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實驗試劑
HBSS：
NaCl 8g/L
KCl 400mg/L
KH2PO4 60mg/L
無水Na2PO4 47.86mg/L
無水葡萄糖 1000mg/L
NaHCO3 350mg/L
實驗材料
妊娠期BALB/c小鼠
實驗步驟
1. 將1~2天齡新生裸鼠窒息后，置于培養(yǎng)皿中，用1%碘聚乙烯吡咯烷酮液洗凈裸鼠，流水*沖洗，然后用70%乙醇洗兩次。小鼠應(yīng)立即使用，若待處理的小鼠數(shù)量較多，可置冰上30min。
2. 去除小鼠的四肢和尾巴。
3. 將小鼠從尾巴至鼻子的皮膚作一簡單切口，用大鼠牙齒鑷輕輕將整個身體的皮膚剝下，用一把鑷子夾住身體，另一把鑷子拉開皮膚。
4. 將剝下的皮膚組織置于放在冰上的無菌培養(yǎng)皿表面，直至所有的皮膚收集完畢。
5. 用2把大鼠牙齒鉗夾住皮膚組織，在含2.5%胰蛋白酶的HBSS無菌培養(yǎng)皿中漂洗皮膚組織（組織在下），然后置4oC過。表皮不應(yīng)淹沒在胰蛋白酶液中。
6. 從胰蛋白酶處理液中取出組織，將表皮面朝下置于干燥的無菌細胞培養(yǎng)皿表面。表皮易于貼附于塑料上，組織用組織鉗扯去，鼠齡與此有影響，天齡越大，去其表皮越困難。
7. 用剪刀小心地將表皮殘留物剪碎，置于含“常規(guī)"培養(yǎng)液（MEM含10%FCS，100IU/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，2~4mmol/L L-谷氨酰胺；每5只小鼠皮膚用10ml）的無菌燒瓶中，磁力攪拌器37oC劇烈攪拌45min。
8. 用4層無菌Nitex紗布（16um孔，Martin提供）過濾液體。當其他細胞通過時角質(zhì)層細胞留在紗布的表面。
9. 用培養(yǎng)瓶將細胞洗下，培養(yǎng)基的用量約為一塊皮膚10ml，將細胞接種于塑料細胞培養(yǎng)瓶中或玻璃蓋玻片上，37oC培養(yǎng)4~12h。
10. 4~12h后觀察培養(yǎng)皿表面的細胞群。
11. 將細胞轉(zhuǎn)移至低鈣培養(yǎng)液，角質(zhì)細胞將開始繁殖。這種轉(zhuǎn)移防止細胞的分層。低鈣液由MEM（無鈣）和10%螯合的FCS（同樣含有正常水平的青霉素、鏈霉素）組成。螯合的血清按下法準備：每50ml血清需20g樹脂，Chelex 100（Bio-Rad）。將樹脂置于水中，40g/L，pH約為7.4，放置濾紙于漏斗上，過濾樹脂。加入樹脂于FCS中，攪拌60min。接著過濾使血清變得清亮，再用0.45ug濾紙除菌。后者過濾過程較慢。需用購買的商品化濾器。*培養(yǎng)液中鈣離子濃度約為0.09mmol/L，與0.15mmol/L鈣濃度相比這是普通培養(yǎng)液。
注意事項
小鼠角質(zhì)細胞在低鈣中維持至1周時間，盡管細胞活力有所降低。可通過商業(yè)途徑如Clonetics和GIBCO/BRL獲得書中低鈣、無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)角質(zhì)細胞。膠質(zhì)細胞在這種培養(yǎng)液中能保存較長時間，并在多數(shù)情況下進行幾次分裂。為了誘導(dǎo)角質(zhì)細胞分層，應(yīng)向細胞中加入正常水平的鈣。
使用一次性塑料組織培養(yǎng)器材，而不是玻璃器材。若確需使用玻璃器材，應(yīng)用酸浸泡后再行高壓滅菌。需要使用的器材還有大叔牙齒鉗、尖解剖剪、活組織吸取器。上述器材應(yīng)高壓滅菌或在95%乙醇中浸泡、燒灼。
