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三、操作步驟（一）取材、冰凍切片：將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1MPBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1MPBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交玻片上，切片厚度為15-20μm。（二）探針制備與檢測（定量）：1.隨機引物制備cDNA核酸探針以DIGDNA標記檢測試劑盒
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原位雜交組織（或細胞）化學（InsituHybridizationHistochemistry，ISHH）簡稱原位雜交（InSituHybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交，
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標簽：限制性內切酶消化DNA影響限制性內切酶反應的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。這種抑制可通過增加酶作用單位數(shù)、增大反應體枳以稀釋可能的抑制劑或延長反應時間來加以克服。實驗方法單酶單DNA樣品消化消化多個DNA部分消化實驗方法原理進行限制酶切割反應只需簡單地將酶和DNA樣品放在合適的反應緩沖液溫育，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強度、溫育溫度和時間都依具體的反應而改變。實驗材料DNA試劑、試劑盒TE酶切緩沖液EDTA儀器、耗材電泳儀實驗步驟1.混合下列溶液于一個無菌的微量離心管
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斑點和狹線印跡是一種將混合的未經分離的面定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上進行雜交分析的簡單技術。用來檢測被印跡的1DNA制品中靶序列的相對豐度。實驗方法多樣抽濾法實驗材料DNA試劑、試劑盒SSCNaClNaOHTris·Cl儀器、耗材紫外透射儀電泳儀多樣抽濾加樣器實驗步驟1.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的尼龍膜，將膜置于6×SSC的表面讓其自然浸沒。放置10min。2.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的Whatman3MM濾紙，用6×SSC浸濕。3.將Whatman3MM濾紙置于多樣抽濾加樣器上，將膜
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*節(jié)概述質粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。如果要克隆較小的DNA片段（＜10kb）且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段,然后體外使兩者相連接,再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中,如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如
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采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進行酶切以獲得相應的粘末端進行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同，這時可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求，加入第二種酶進行酶切；3）使用通用緩沖液進行雙酶切。具體要根據(jù)酶的反應要求進行，盡量避免星號活力。一材料、試劑和儀器：1材料：質粒DNA
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甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）甲基化是目前的研究熱點，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享。希望能夠對大家有所幫助。*部分基因組DNA的提取。這一步沒有懸念，*可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。使用兩者的細節(jié)：1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水
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一、原理：在濃氯化鈉（1―2mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化鈉（0.14mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。將抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，DNA或（RNA）即與蛋白質分開，可用氯仿―異戊醇將蛋白質沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇，DNA即析出。為了防止DNA或（RNA）酶解，提取時加入EDT
