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詳解析ELISA植物病毒血清學(xué)檢測技術(shù)
閱讀：1279 發(fā)布時間：2014-11-17| 提 供 商 | 上海滬鼎生物科技有限公司 | 資料大小 | 103.3KB |
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一、目的
(Fab')2-ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測定中zui靈敏的檢測方法之一，配合背景反應(yīng)很淺的堿性磷酸酯酶檢測下限可以達到納克水平，對于少量樣品或含量低的病毒檢測效果好。它利用蛋白酶去掉抗體IgG中的Fc片段，使雙抗體夾心的優(yōu)點只使用一種抗體就可以實現(xiàn)。
二、實驗材料和用具
1.?；钥贵w免疫球蛋白IgG(濃度約為1mg/ml)。
2.系統(tǒng)感染病毒的植株和健康植株。
3.酶標記羊抗兔抗體球蛋白IgG(市售)或A蛋白標記的堿性磷酸酯酶(Sigma產(chǎn)品)。
4.酶聯(lián)板、微量加樣器、洗瓶、酶聯(lián)讀數(shù)儀。
5.抗原包被緩沖液、洗滌緩沖液、IgG稀釋緩沖液、底物溶液。
三、實驗步驟
1.配制緩沖液
① 抗原包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)
Na2C031.59g；NaHCO32.93g；NaN30.2g蒸餾水加至1升。
② 洗滌緩沖液(0.02MPBS-吐溫緩沖液，PBS-T，pH7.4)
NaCl8.0g ；Na2HPO4 '12H2O2.9g；KH2PO4 0.2g；
KCl0.2g；NaN30.2g；蒸餾水加至1升后加Tween-200.5ml.
③ IgG稀釋緩沖液(0.02MPBS-T，牛血清白蛋白溶液)
取0.1g牛血清白蛋白溶于用滅菌蒸餾水配制的PBS-T緩沖液100ml中即成。
④ 底物溶液(鄰苯二胺溶液)
a液：檸檬酸19.2克加水溶至1000ml為0.1M檸檬酸溶液
b液：Na2HPO4.12H2O71.6g加水溶至1000ml為0.2MNa2HPO4溶液。
取a液24.3ml加b液25.7ml混合即成磷酸鹽-檸檬酸緩沖液pH5.0 。
稱取40mg鄰苯二胺，溶解后過濾，加上述緩沖液至100ml，臨用前加30%H2O2 0.15ml即成。
⑤ 堿性磷酸脂酶底物緩沖液：
二乙醇胺緩沖液：二乙醇胺97ml，蒸餾水800ml，混合，用濃HCl調(diào)pH=9.8，加水至1000ml。取硝基酚磷酸pNPP60mg溶于100ml上述二乙醇胺緩沖液中，即為底物緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用，時間長了會變色)。
堿性磷酸脂酶標記的A蛋白，溶于1.0ml50%甘油中即可使用。
2.取顯癥葉片和健康葉片用抗原包被緩沖液分別配制1:10，1:100，1:1000樣品懸浮液，過濾或低速離心后備用。
3.按設(shè)計(同實驗三)在酶聯(lián)板上加樣，每孔200μl，(Fab')2以1/2000-4000的比例稀釋在50mM包被緩沖液(pH9.6)中；在30℃下孵育四小時，或4℃放置一個晚上(時間長，包被好)；
4.洗板三次同實驗三；
5.樣品稀釋在提取緩沖液中，4℃下孵育放置一個晚上；洗板同前；
6.IgG(可用未純化的抗血清)以1/2000-4000的比例稀釋在提取緩沖液中，30℃孵育三小時，洗板同前；
7.酶標A蛋白以1/2500比例稀釋在提取緩沖液中，30℃孵育三小時，洗板同前；
8.加底物，室溫孵育不超過30分鐘(過氧化物酶)，2-4小時(堿性磷酸酯酶)，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定結(jié)果。
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