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HL70017.6 v.A

 

乙酰膽堿酯酶活性抑制劑篩選比色法檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

乙酰膽堿酯酶活性抑制劑篩選比色法檢測試劑是一種旨在通過乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在抑制劑存在與否的情況下，所釋放出巰基膽堿，與Ellman試劑反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物，出現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來評價樣品酶活抑制能力的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種抑制劑篩選檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又稱為紅細(xì)胞膽堿酯酶（RBC cholinesterase），廣泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在腦組織、神經(jīng)肌肉連接處（neuromuscular junction）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能突觸（cholinergic synapses）和紅細(xì)胞膜上高度表達(dá)，催化主要的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的水解反應(yīng)，產(chǎn)生乙酸和膽堿，終止突觸傳導(dǎo)。其功能在于調(diào)節(jié)乙酰膽堿作用。神經(jīng)毒氣，例如有機(jī)磷沙（Sarin），抑制乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉癱瘓，終發(fā)生窒息（asphyxiation）。血清乙酰膽堿酯酶濃度顯著降低與有機(jī)磷殺蟲劑中毒有關(guān)，因此血液檢測是環(huán)境污染的重要指標(biāo)。基于人工合成底物碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide），在抑制劑存在與否的情況下，通過乙酰膽堿酯酶的作用，水解產(chǎn)生乙酸和硫代膽堿（thiocholine），與Ellman試劑5，5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析乙酰膽堿酯酶抑制劑的效應(yīng)。乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

   

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）  毫升

反應(yīng)液（Reagent B）  毫升

底物液（Reagent C）       毫升

陰性液（Reagent D）    毫升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

 

 

用戶自備

 

乙酰膽堿酯酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里備用
• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長412nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

• 抑制劑篩選

 

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、*活性和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

 

內(nèi)容物	空背景對照	樣本背景	*酶活性	待測抑制劑酶活性
緩沖液（Reagent A）	xx微升	xx微升	xx微升	xx微升
陰性液（Reagent D）	xx微升	xx微升	xx微升	——
待測抑制劑	——	xx微升	――	xx微升
用戶自備的純化酶	——	——	xx微升（1毫單位）	xx微升（1毫單位）
96孔板每孔總量	空背景對照孔 （xx微升）	樣本背景孔 （xx微升）	*活性孔 （xx微升）	待測抑制劑樣品孔 （xx微升）
輕輕搖動酶標(biāo)板，混勻，放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作

 

• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent C） 
• 輕輕搖動酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 即刻放進(jìn)37℃酶標(biāo)儀檢測：測讀15分鐘
• （選擇步驟）*酶活計算：

 

 

• 抑制活性計算：

 

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)15分鐘
• 用戶根據(jù)實際需求，可以調(diào)整純酶的濃度 
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用乙酰膽堿酯酶抑制劑（1,5-bis(4-allyldimethylammoniumphenyl)pentan-3-one dibromide； BW284c51；IC50=30納摩爾）作為抑制劑對照 
• 乙酰膽堿酯酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠生成1微摩爾硫代膽堿所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列乙酰膽堿酯酶檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感