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真菌/酵母細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

真菌/酵母細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過高度敏感的陽離子熒光羰花青染料結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體膜電位的變化，即內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低，來分析線粒體內(nèi)膜功能的完整性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種實(shí)驗(yàn)用真菌/酵母菌株細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位檢測(cè)。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測(cè)，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

真菌/酵母細(xì)胞是一種低等單細(xì)胞真核生物，具有細(xì)胞生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡(jiǎn)單明了等原核生物的特點(diǎn)。作為模式生物，它具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，在分子遺傳學(xué)方面認(rèn)識(shí)早，先作為外源基因表達(dá)的細(xì)胞宿主。陽離子熒光羰花青染色劑JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro- 1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）是一種對(duì)膜電位高度敏感的染色劑。它特異性地進(jìn)入線粒體，分布和結(jié)合在線粒體基質(zhì)上。線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。電位高，JC-1形成聚集體，而濃度高，熒光顯色為紅色或桔紅色；反之，則為綠色。熒光減弱表明線粒體內(nèi)膜功能受到損害。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）                       80毫升

染色液（Reagent B）                      100微升

平衡液（Reagent C）                       20毫升

產(chǎn)品說明書               1份

 

保存方式

 

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于真菌/酵母染色的容器

載玻片：用于染色觀察

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

 

 

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，平衡液（Reagent C）放進(jìn)28℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入990微升平衡液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟5至7一次
• 加入500微升含有染色液（Reagent B）和平衡液（Reagent C）的染色工作液，混勻（注意：參見注意事項(xiàng)7）
• 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里或恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入500微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

 

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

 

• 混勻后，移出50微升在載玻片上
• 即刻進(jìn)行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（單濾波或雙濾波）：

觀察紅色熒光：濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm或羅丹明（rhodamine）濾波器激發(fā)波長(zhǎng)540nm，

散發(fā)波長(zhǎng)570nm或德州紅（Texas Red）濾波器激發(fā)波長(zhǎng)590nm，散發(fā)波長(zhǎng)610nm――可見

亮紅色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

 

觀察綠色熒光：濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm或熒光素（Fluorescein）濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490nm，

散發(fā)波長(zhǎng)520nm――如果綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明線粒體膜電位受到破壞，未結(jié)合JC

－1染料在細(xì)胞漿里

 

 

 

 

 

 

 

 

 

選擇二、細(xì)胞流式儀分析

 

• 混勻后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀雙通道分析：觀察50000個(gè)細(xì)胞以上

 

 

激發(fā)波長(zhǎng)	488nm	488nm
匹配熒光染料	異硫氰酸熒光素（FITC）	藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）
熒光顏色	綠色	紅色
散發(fā)波長(zhǎng)	530	575
流式儀通道	FL1	FL2
熒光增強(qiáng)	膜損傷	膜電位正常

 

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色杯里
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定（單一測(cè)定或雙重測(cè)定）：

單一測(cè)定：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm，獲得相對(duì)熒光單位（RFU）：RFU值高表明線粒體膜電位正常

 

雙重測(cè)定：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm，獲得紅色熒光單位

激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm，獲得綠色熒光單位――紅色熒光單位除以綠色熒光單位終獲得熒光比值：比值高表明線粒體膜電位正常