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主要用途

 

真菌/酵母細(xì)胞線粒體粗提分離試劑是一種旨在使用生物、化學(xué)和物理方法相結(jié)合，有效去除真菌/酵母菌細(xì)胞壁，進(jìn)一步快速且充分裂解真菌/酵母菌細(xì)胞，從而分離出完整而純化的線粒體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種新鮮培養(yǎng)或凍存的野生型或突變型真菌/酵母菌菌株細(xì)胞的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品*佳。

 

技術(shù)背景

 

線粒體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：第一，通過(guò)機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過(guò)低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器；第三，通過(guò)高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過(guò)等密度離心獲得純度更高的線粒體。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）                      250毫升

平衡液（Reagent B）                   250毫升

酶解液（Reagent C）                   500微升

裂解液（Reagent D）                        40毫升

凈化液（Reagent E）                    10毫升

強(qiáng)化液（Reagent F）                     5毫升

保存液（Reagent G）                   100毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)               1份

 

保存方式

 

保存酶解液（Reagent C）和凈化液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，嚴(yán)格避免污染；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于細(xì)胞收集后離心或清洗

1.5毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

4℃臺(tái)式高速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent E）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

1． 準(zhǔn)備好50毫升新鮮真菌/酵母菌樣品

2． 在分光光度儀上測(cè)OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷細(xì)胞/毫升；總量為5 X 10⁸細(xì)胞） 

3． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管

4． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入25毫升清理液（Reagent A），混勻

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g

8． 小心抽去上清液

9． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻

10． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g

11． 小心抽去上清液

12． 加入2毫升平衡液（Reagent B），混勻

13． 加入50微升酶解液（Reagent C），混勻

14． 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻

15． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻

16． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g

17． 小心抽去上清液

18． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻

19． 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育30分鐘，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟21

20． 同時(shí)將平衡液（Reagent B）置入冰槽里預(yù)冷30分鐘（注意：以下步驟在4℃環(huán)境下進(jìn)行）

21． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g

22． 小心抽去上清液

23． 加入5毫升預(yù)冷的平衡液（Reagent B），混勻

24． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g

25． 小心抽去上清液

26． 加入5毫升含有裂解液（Reagent D）和凈化液（Reagent E）的裂解工作液

27． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群

28． 選擇下列其中一種方法：

 

方法一：物理處理法

1． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

2． 在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞（約20下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)10）

3． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管

4． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

5． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

6． 放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

7． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

8． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent G）

9． （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g

10． （選擇步驟）小心抽去上清液

11． 加入1毫升保存液（Reagent G），充分混勻

12． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

 

方法二：化學(xué)處理法

1． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

2． 加入500微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent F）

3． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

4． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)11）

5． 加入5毫升預(yù)冷的保存液（Reagent G），輕輕搖動(dòng)試管混勻

6． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

7． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

8． 放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

9． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

10． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent G）

11． （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g

12． （選擇步驟）小心抽去上清液

13． 加入1毫升保存液（Reagent G），充分混勻

14． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

 

注意事項(xiàng)

 

1． 本產(chǎn)品為10次操作（50毫升菌液：1克細(xì)胞濕重或5 X 10⁸細(xì)胞）

2． 其它實(shí)際操作的細(xì)胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如10毫升菌液（OD600=1）：試劑用量是標(biāo)準(zhǔn)用量的五分之一

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 操作時(shí)，避免污染母液

5． 50毫升（OD600＝1）菌液濕重約1克

6． 細(xì)胞生長(zhǎng)條件影響線粒體的質(zhì)量：建議在有氧條件下富含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)

7． 實(shí)驗(yàn)步驟20以下的所有操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)下進(jìn)行

8． 建議使用足夠的細(xì)胞量

9． 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間

10． 通常勻化次數(shù)為20下（或細(xì)胞顆粒群消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細(xì)胞會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)

11． 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細(xì)胞會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)

12． 通常1克細(xì)胞濕重或5 X 10⁸細(xì)胞的線粒體含量為50微克線粒體蛋白，但不同菌株或培養(yǎng)條件會(huì)存在差異；建議使用純化線粒體蛋白質(zhì)濃度定量測(cè)定試劑盒（HL10059）測(cè)定線粒體蛋白濃度

13． 如果需要計(jì)量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

14． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量尤為理想

15． 制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>，嚴(yán)格避免反復(fù)凍融

16． 如果需要獲得95％以上純度的線粒體，使用真菌/酵母細(xì)胞線粒體分離（高純）試劑盒（HL10049.3）

17． 線粒體正?；钚詼y(cè)定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細(xì)胞色素吸收峰譜等

18． 線粒體內(nèi)外膜完整性測(cè)定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色

19． 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等

20． 本公司提供系列真菌/酵母細(xì)胞線粒體試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整

3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正?；钚?/span>

4． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶