化工儀器網(wǎng)技術(shù)文章
DNase I 溶液使用說明
閱讀：1166 發(fā)布時間：2023-4-14產(chǎn)品簡介：
DNase I ， 即 Deoxyribonuclease I ， 即脫氧核糖核酸酶 I ， 是一種可以消化單鏈或雙鏈 DNA 產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNase I 水解單鏈或雙 鏈 DNA 后的產(chǎn)物， 5'端為磷酸基團(tuán)，3'端為羥基。
DNase I 活性依賴于鈣離子， 并能被鎂離子或二價錳離子激活 。鎂離子存在條件下， DNase I 可隨機(jī)剪切雙鏈 DNA 的任意位點(diǎn)；二價錳離子存在條件下，DNase I 可在同一位點(diǎn) 剪切 DNA 雙鏈，形成平末端， 或 1 -2 個核苷酸突出的粘末端。
特點(diǎn)：不含 RNase (RNase free)， 可以用于各種 RNA 樣品的處理 。提供了用于 DNase I 失活所需的 EDTA。
用途：制備不含 DNA 的 RNA 樣品；RT -PCR 反應(yīng)前 RNA 樣品中去除基因組 DNA 等可 能的 DNA 污染；體外 T7, T3, SP6 等 RNA Polymerases 催化的 RNA 轉(zhuǎn)錄后去除 DNA 模板； DNase I footprinting 研究 DNA -蛋白質(zhì)相互作用； 缺口平移(nicktranslatioin)； 產(chǎn)生 DNA 隨 機(jī)片段文庫； 細(xì)胞凋亡 TUNEL 檢測中部分剪切基因組 DNA 作為陽性對照。
來源：從牛胰腺純化得到 。分子量： 約 32kDa(單體)。
活性定義：37°C 10 分鐘內(nèi)，將能夠降解 1 μg pBR322 質(zhì)粒 DNA 所需的酶量定義為 1 個活性單位。
活性檢測條件：40mM Tris -HCl (pH8.0) ， 10mM MgSO4， 1mM CaCl2 ， 1 μg of pBR322 DNA 。純度：不含其它 DNA 內(nèi)切酶和外切酶，不含 RNA 酶。
保存條件：
-20°C 保存， 一年內(nèi)有效。
操作流程：
1 RT -PCR 反應(yīng)前 RNA 樣品中 DNA 的去除：
1.1 DNA 模板限制性核酸內(nèi)切酶作用后線性化。酚/氯仿和氯仿/異丙醇提取 DNA，用乙醇沉 淀后， 溶于適量的無菌去離子水中。
1.2 向一無 RNA 酶的 EP 管中依次加入下列試劑：
RNA | 1 μg |
反應(yīng)緩沖液(10×) | 1 μl |
補(bǔ)充經(jīng) DEPC 處理的去離子水 | 至 9 μl |
DNase I (1U/μl) | 1 μl |
注意：如需處理較大量的 RNA 樣品， 可以按照比例放大上述反應(yīng)體系 。如果能在上述反應(yīng) 體系中加入適量 Ribonuclease inhibitor 以防止 RNA 降解則更佳。
1.3 37°C 孵育 30min。
1.4 向上述反應(yīng)體系中加入 1 μl 25mM EDTA，65°C 孵育 10min， 以失活 DNase I 。注意：在 沒有鏊合劑如 EDTA 等存在情況下加熱， RNA 可被水解。
1.5 上述加熱處理過的 RNA 樣品即可直接用于處理好的 RNA 可用作 RT -PCR 反應(yīng)的模板。
2 體外 RNA 反轉(zhuǎn)錄后模板 DNA 的去除：
2.1 在每含有 0.5 μg 模板 DNA 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入 1U DNase I 。注意：在某些情況下， 模板 DNA 消化所需的 DNase I 的量需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。
2.2 37°C 孵育 15min。
2.3 酚/氯仿抽提失活 DNase I。
3 缺口平移進(jìn)行 DNA 標(biāo)記
3.1 參考如下表格設(shè)置反應(yīng)
Reaction Buffer (10×) for DNA Polymerase I | 2.5 μl |
3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP) * | 1.25μl |
[α -32P]-dNTP, ~110TBq/mmol (3000Ci/mmol) | 1.85 -3.7MBq (50 -100μ Ci) |
DNase I (freshly diluted to 0.002U/μl)** | 1 μl |
DNA Polymerase I, E.coli | 0. 5 -1.5 μl (5 -15U) |
Template DNA | 0.25μg |
補(bǔ)充無核酸酶去離子水 | 至 25μl |
* 3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP)：分別取除已經(jīng)標(biāo)記的 dNTP 外的 3 種 dNTP(100mM) 各 1 μl 加入到 97μl 的無核酸酶的去離子水中混勻即可 。例如標(biāo)記的為 dATP，則需混合 dTTP、dCTP 和 dGTP 三種 dNTP 至每種的最終濃度為 1mM。配制好的 dNTP 可存放于 -20°C 以備后續(xù)使用。
** DNase I 可以用 1 × Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進(jìn)行稀釋。
Reaction Buffer (10 ×) for DNA Polymerase I ： 500mM Tris -HCl (pH7.5 at 25°C) ， 100mM MgCl2 ， 10mM DTT。
3.2 立即 15°C 孵育 15~60min。
3.3 上述反應(yīng)體系中加入 1μl 0.5M EDTA(pH 8.0)終止反應(yīng)。
3.4 從中取出少量例如 1 μl 檢測標(biāo)記效率 。通常標(biāo)記效率至少可以達(dá)到 108cpm/μg DNA。
3.5 可用 Sephadex G -50 或 Bio -Gel P -60 去除[α -32P]-dNTP， 以純化獲得標(biāo)記的 DNA。
溫馨提示：
為了您的自身安全，使用試劑前，請做好防護(hù)，如穿實(shí)驗(yàn)服， 帶手套等。