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免疫學(xué)細(xì)胞實驗，如此簡單！
陳老師最近不再只熱衷研究分子互作了。體外分子水平的研究要結(jié)合細(xì)胞學(xué)的體內(nèi)研究，才能得到更全面更真實的認(rèn)識。尤其是免疫學(xué)研究中的細(xì)胞學(xué)實驗，包括細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞功能，細(xì)胞間的相互作用等，更是被越發(fā)看重。傳統(tǒng)的方法，比如某個時間點對細(xì)胞固定染色通過顯微鏡拍照的方式觀察細(xì)胞的變化情況，或是用流式、ELISA、PCR等終點法實驗對細(xì)胞的免疫反應(yīng)進行檢測，而且這還不是活細(xì)胞狀態(tài)。
如果能夠通過實時動力學(xué)反映出活細(xì)胞的狀態(tài)隨時間的變化，豈不是更好？
這不，陳老師最近好好地研究了一番賽多利斯生物分析的三劍客之一——Incucyte®實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)，直接把設(shè)備置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，不需要拿出培養(yǎng)箱觀察，即可對活細(xì)胞的行為進行實時、動態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測，可長達數(shù)周，即可得到生長曲線/IC50/EC50，又可生成圖片及視頻。這可太適合免疫學(xué)相關(guān)的細(xì)胞學(xué)實驗了。
免疫學(xué)研究中常見的細(xì)胞實驗：
基礎(chǔ)研究：細(xì)胞增殖、免疫分型、免疫細(xì)胞激活與分化、細(xì)胞健康與凋亡等
細(xì)胞功能：免疫細(xì)胞殺傷、吞噬與清除作用、NETosis等
藥效評價：趨化/遷移、抗體內(nèi)化、病毒感染等
有了Incucyte®實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)，以上這些應(yīng)用與分析都信手拈來。
今天陳老師就先給大家介紹其中的五個應(yīng)用：
細(xì)胞增殖及計數(shù)
細(xì)胞鑒定和免疫分型
細(xì)胞激活和分化
細(xì)胞健康和凋亡
免疫細(xì)胞殺傷（細(xì)胞溶解）
01
細(xì)胞增殖及計數(shù)
相比傳統(tǒng)“終點法“，Incucyte®利用實時活細(xì)胞分析更高效地得到細(xì)胞增殖及計數(shù)結(jié)果（表1），并提供靈活、便捷的實驗方案（圖1）。既可以直接進行無標(biāo)記的細(xì)胞匯合度分析，又可通過專業(yè)的Incucyte® Cell-by-Cell Analysis軟件進行無標(biāo)記的細(xì)胞計數(shù)。通過面積尺寸、形狀及熒光強度等指標(biāo)在單個細(xì)胞水平上對視野中的所有細(xì)胞進行自動分析和計算，得到生長曲線等數(shù)據(jù)結(jié)果。
終點法 | 實時活細(xì)胞技術(shù) |
工作量及時間跨度大：24小時測定一次，每次實驗需要接種四塊板 | 置于培養(yǎng)箱中進行長時間監(jiān)測，通量高（可同時監(jiān)測6塊孔板） |
誤差較大，重復(fù)性較差，無法保證每個板或孔接種細(xì)胞均勻 | 鋪板后置入培養(yǎng)箱，無需移動細(xì)胞，保證精度和重復(fù)性 |
需要第三方軟件手動分析 | 軟件自動識別、分析，自動計算細(xì)胞數(shù)量、密度結(jié)果 |
表1. 終點法細(xì)胞增殖測定 vs 實時活細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞增殖測定
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無標(biāo)記的細(xì)胞匯合度分析（confluence）：測量細(xì)胞生長曲線，追蹤變化趨勢 | 無標(biāo)記的細(xì)胞計數(shù)：計算特定細(xì)胞數(shù)目，分析細(xì)胞亞群 | 熒光標(biāo)記法計數(shù)細(xì)胞：使用非干擾型NucLight試劑對細(xì)胞核進行熒光標(biāo)記，實時監(jiān)測細(xì)胞數(shù)目及增值 |
圖1. Incucyte®細(xì)胞增殖及計數(shù)分析
02
細(xì)胞鑒定和免疫分型
熒光標(biāo)記的CD抗體（Abs）被廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)進行細(xì)胞識別和免疫分型，至少有15種人類T細(xì)胞亞型被描述出來（例如，CD4+，CD8+等）。Incucyte®利用相同的原理，對標(biāo)記方法進行改進：
將抗CD抗體結(jié)合到同型匹配的帶有熒光標(biāo)簽的Fc區(qū)域靶向Fab片段，便可通過簡單的一步混合來完成標(biāo)記。在檢測中使用一種非干擾性的背景熒光抑制染料，以改善488 nm的熒光信號，保護細(xì)胞的同時提供更靈活的分析方案。
03
細(xì)胞激活和分化
免疫細(xì)胞的分化和激活是免疫力和免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞通過受體信號傳導(dǎo)進行擴增并產(chǎn)生功能效應(yīng)，最終導(dǎo)致基因表達、分化和表型變化。Incucyte®能夠更清晰、更深入地研究這個過程的復(fù)雜性和動態(tài)性：
a. 通過無標(biāo)記或熒光標(biāo)記，對免疫細(xì)胞活化的形態(tài)變化進行實時監(jiān)測；
b. 使用cell-by-cell軟件模塊對細(xì)胞的圖像分割，進行細(xì)胞分類；
c. 使用Cytolight Rapid試劑監(jiān)測活化T細(xì)胞聚團
04
細(xì)胞健康和凋亡
細(xì)胞健康和細(xì)胞凋亡的測量對于研究藥物、培養(yǎng)條件或基因改造對細(xì)胞生長或活力的影響至關(guān)重要。 Incucyte®通過使用專為活細(xì)胞分析而優(yōu)化的熒光染料，提供了一種非干擾的、“即混即讀"分析方式對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡的時間過程以及它們與細(xì)胞增殖的關(guān)系的洞察。
Caspase 3/7染料在存在活性caspase的作用下發(fā)出熒光，可檢測長期和短期效應(yīng)；Annexin V染料與細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合檢測早期凋亡，細(xì)胞非通透性的DNA結(jié)合熒光探針則可用于檢測細(xì)胞膜的完整性。該方法適用于貼壁細(xì)胞及非貼壁細(xì)胞，并且，無需將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出即可分析細(xì)胞健康和活力，保護細(xì)胞、節(jié)約時間、提高質(zhì)量。
05
免疫細(xì)胞殺傷（細(xì)胞溶解）
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs）、自然殺傷細(xì)胞（NK）和某些中性粒細(xì)胞能夠殺死被感染的或惡性細(xì)胞。對于細(xì)胞殺傷的檢測，可通過檢測垂死的目標(biāo)細(xì)胞中的釋放的Cr-51和細(xì)胞酶（如LDH）等來實現(xiàn)。但這些傳統(tǒng)方法存在諸多弊端，例如放射性。而檢測技術(shù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于：
(1) 高背景信號；
(2) 難以辨別可能來自效應(yīng)（殺傷）細(xì)胞的污染信號；
(3) 如何判定并測量殺傷終點。
Incucyte®巧妙解決了以上難題。無需取出細(xì)胞、無需同位素或抗體標(biāo)記，免清洗。利用實時、連續(xù)的成像方式捕捉細(xì)胞隨時間的變化信息。其中可以用熒光蛋白（如RFP）標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞，當(dāng)它們被裂解時，監(jiān)測熒光的損失。另外也可直接采用annexin V或caspase 3/7測量目標(biāo)細(xì)胞的凋亡。這些方法對于表征檢查點抑制劑、CAR-T細(xì)胞、雙特異性抗體和其他基于免疫的療法的表型效應(yīng)非常有用。
既能不受培養(yǎng)環(huán)境限制進行活細(xì)胞觀察，又能實時分析得到動力學(xué)變化過程，就這么簡單～陳老師今天先介紹到這里，還有5個應(yīng)用，請看下回分解～