明膠酶譜法電泳試劑盒

1. 簡介：
基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細胞外基質的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程，其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視。
 
2. 檢測原理：
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結束后取出凝膠與酶反應Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行50次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。
 
3. 檢測目的:
本試劑盒用于檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。
 
4.  試劑盒組成與儲存：
A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC；
B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC；
C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；
D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；
E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液, 4 ºC。
 
5.檢測步驟：
5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。
5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染Marker 即可。
陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。
注：因為全血成分復雜,MMP活性較低，好的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照
5.3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
5.4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應延長孵育時間為10小時或過夜。
5.6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。
透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。
5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中常見的格式。

注意事項：
1.制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH在7.5-7.6，復性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
6.明膠要4度保存，配好后1周內使用

凝膠制備：
1.玻璃板對齊后放入夾中，垂直卡緊，加滿水檢漏。
2.配10%分離膠，APS和TEMED作用為促凝，后灌膠前加。若板不漏水，則將水倒出，并用吸水紙洗凈后灌膠，灌至大約3/4處，上面加滿水壓平。
3.配濃縮膠，同樣地，APS和TEMED后加，分離膠灌入約30min后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝，同時仔細觀察可見玻板水和膠間有一條折線，說明膠已凝固。
4.將上面的水倒去，吸水紙洗凈，灌入濃縮膠，灌滿，注意一定不要有氣泡，然后將梳子插入，注意保持水平，約30min后凝固可用。
5.拔梳子在電泳緩沖液中拔，加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣，注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔，樣品混勻時要輕，不要產生氣泡，否則加樣時易導致逸出而使結果不準確。

明膠酶譜法電泳試劑盒