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丙酮酸激酶（Pyruvatekinase，PK）試劑盒說明書
一、 測定意義
丙酮酸激酶酶催化糖酵解過程中的zui后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，
也是動(dòng)植物組織中產(chǎn)生ATP 的關(guān)鍵酶之一，因此測定動(dòng)植物組織中PK 的活性具有重要意義。
二、 測定原理
在二磷酸腺昔（ADP）存在的條件下丙酮酸激酶能夠催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化
成丙酮酸，丙酮酸與2, 4 -二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在堿性溶液中顯棕
紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比，由此計(jì)算丙酮酸激酶活力。三、試驗(yàn)中所需的儀
器和設(shè)備
可見分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀、37℃恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比
色皿或酶標(biāo)板、蒸餾水
四、試劑的組成和配制
試劑一：粉劑×1 瓶，常溫保存，用時(shí)加入50mL 雙蒸水溶解，4℃保存3 個(gè)月；試劑二：液
體13 mL×1 瓶，4℃保存3 個(gè)月；
試劑三：粉劑×1 支，常溫保存；用時(shí)加1mL 雙蒸水充分溶解;試劑四：
粉劑×1 支，-20℃保存；用時(shí)加1.2 mL雙蒸水充分溶解；試劑五：粉劑
×1 支，-20℃保存；用時(shí)加550μL 雙蒸水充分溶解；試劑六：2 mmol/L
標(biāo)準(zhǔn)液母液1mL，-20℃保存1 個(gè)月；試劑七：儲(chǔ)備液15 mL，4℃避光保
存3 個(gè)月；
試劑八：終止試劑50 mL，4℃保存3 個(gè)月；
五、粗酶液的提取
準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比（g/mL）加9 倍試劑一，制成10%勻漿。8000g/min
離心10 min，取上清液待測，同時(shí)測定組織蛋白含量。
六、測定步驟
取試劑二11.4mL，試劑三0.69mL，試劑四1.2mL 加入混合液試劑瓶中，該試劑
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瓶中含有1.71mL液體，配成總體積為15mL的混合液（該混合液配好后4℃保存1個(gè)月），按下表進(jìn)行操作。
空白孔B
標(biāo)準(zhǔn)孔S
測定孔U
對照孔C
待測樣本(μL)
10
10
混合液 (μL)
275
275
275
275
試劑五 (μL)
10
蒸餾水 (μL)
20
10
10
試劑六 (μL)
10
充分混勻，37℃水浴15 分鐘
試劑七(μL)
250
250
250
250
充分混勻，37℃水浴15 分鐘
試劑八(μL)
750
750
750
750
充分混勻，靜置3 分鐘，450 nm下測定吸光度
注意：
1. 以上反應(yīng)體系用1 mL玻璃比色皿測定，若需要用酶標(biāo)儀測定，將反應(yīng)體系中各試劑組 成縮小5 倍即可。 2. 粗酶液的提取必須在0℃-4℃中操做完成，以防止酶變性失活。 3. 測定過程中所有試劑必須在冰上放置。
七、動(dòng)植物組織中PK活力單位的計(jì)算：
丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：
將2mmol/L的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水分別稀釋成1 mmol/L、0.8mmol/L、0.6mmol/L、0.4mmol/L、0.2mmol/L溶液，按照測定操作表中標(biāo)準(zhǔn)孔體系測定不同濃度的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值。
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計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=0.4667χ-0.0013（χ為丙酮酸濃度，mmol/L； y為吸光值）推出：χ=（y+ 0.0013）÷0.4667（χ為丙酮酸濃度，mmol/L；y為吸光值） 單位定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)活力單位。
組織中PK活力= （U/mgprot）
（ODU- ODC）-0.00130.4667×15×Cprot
×1000
ODU： 測定孔吸光值； ODC： 對照孔吸光值： Cprot： 待測樣本蛋白濃度(mg/mL)； 15 分鐘： 反應(yīng)時(shí)間；

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