上海信帆生物科技有限公司專(zhuān)業(yè)提供各類(lèi)科研用檢測(cè)試劑盒，備有大量現(xiàn)貨，提供技術(shù)指導(dǎo)。如有任何需求，歡迎前來(lái)咨詢(xún)。

一、 測(cè)定意義

丙酮酸激酶酶催化糖酵解過(guò)程中的zui后一步反應(yīng)，是糖酵解過(guò)程中的主要限速酶之一， 也是動(dòng)植物組織中產(chǎn)生 ATP 的關(guān)鍵酶之一，因此測(cè)定動(dòng)植物組織中 PK 的活性具有重要意 義。

二、 測(cè)定原理

在二磷酸腺昔（ADP）存在的條件下丙酮酸激酶能夠催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化 成丙酮酸，丙酮酸與 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在堿性溶液中顯棕 紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比，由此計(jì)算丙酮酸激酶活力。 三、試驗(yàn)中所需的儀器和設(shè)備

可見(jiàn)分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀、37℃恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃 比色皿或酶標(biāo)板、蒸餾水

四、試劑的組成和配制

試劑一：粉劑×1 瓶，常溫保存，用時(shí)加入 50mL 雙蒸水溶解，4℃保存 3 個(gè)月； 試劑二：液體 13 mL×1 瓶，4℃保存 3 個(gè)月；

試劑三：粉劑×1 支，常溫保存；用時(shí)加 1mL 雙蒸水充分溶解; 試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；用時(shí)加 1.2 mL 雙蒸水充分溶解； 試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；用時(shí)加 550μL 雙蒸水充分溶解； 試劑六：2 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)液母液 1mL，-20  ℃保存 1 個(gè)月； 試劑七：儲(chǔ)備液 15 mL，4℃避光保存 3 個(gè)月；

試劑八：終止試劑 50 mL，4℃保存 3 個(gè)月；

五、粗酶液的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取組織重量，按重量體積比（g/mL）加 9 倍試劑一，制成 10%勻漿。8000 g/min

離心 10 min，取上清液待測(cè)，同時(shí)測(cè)定組織蛋白含量。

六、測(cè)定步驟

取試劑二 11.4mL，試劑三 0.69mL，試劑四 1.2mL 加入混合液試劑瓶中，該試劑

瓶中含有 1.71mL 液體，配成總體積為 15mL 的混合液（該混合液配好后 4℃保 存 1 個(gè)月），按下表進(jìn)行操作。

充分混勻，37℃水浴 15 分鐘

充分混勻，37℃水浴 15 分鐘

充分混勻，靜置 3 分鐘，450 nm 下測(cè)定吸光度

注意：

1. 以上反應(yīng)體系用 1 mL 玻璃比色皿測(cè)定，若需要用酶標(biāo)儀測(cè)定，將反應(yīng)體系中各試劑組

成縮小 5 倍即可。

2. 粗酶液的提取必須在 0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶變性失活。

3. 測(cè)定過(guò)程中所有試劑必須在冰上放置。

七、動(dòng)植物組織中 PK 活力單位的計(jì)算：

丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：

將 2 mmol/L 的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水分別稀釋成 1 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、 0.4 mmol/L、0.2 mmol/L 溶液，按照測(cè)定操作表中標(biāo)準(zhǔn)孔體系測(cè)定不同濃度的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品 的吸光值。 

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式為 y = 0.4667χ - 0.0013（χ 為丙酮酸濃度，mmol/L； y 為吸光值） 推出：χ = （y + 0.0013）÷0.4667（χ 為丙酮酸濃度，mmol/L； y 為吸光值）

單位定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成 1 nmol 丙酮酸定義為一個(gè)活力單位。