丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒

測(cè)定意義 PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來(lái)。

測(cè)定原理 PDH催化丙酮酸脫氫，同時(shí)還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致600nm光吸收的減少。 需自備的儀器和用品 可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配制 試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存； 試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存； 試劑三：1mL×1支，-20℃保存； 試劑四：液體50mL×1瓶，4℃保存； 試劑五：粉劑×1支，4℃保存； 試劑六：粉劑×1支，4℃保存； 試劑七：粉劑×1支，4℃保存； 試劑八：粉劑×1支，4℃保存; 工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六、試劑七和試劑八轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用。 PDH的提取
1、 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 4 ℃ 600 g離心5min。
3、 將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的PDH（此步可選做）。
5、 在沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于PDH活性測(cè)定。
丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒測(cè)定步驟
1、 調(diào)零
用蒸餾水于605nm處調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）取900μL工作液加入1mL玻璃比色皿，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）中孵育5min。 （2）取出比色皿，加入50μL酶液，混勻；立即記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）中準(zhǔn)確反應(yīng)1min，記錄605nm處1min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。 注意事項(xiàng) 1、測(cè)定過(guò)程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。 2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

PDH活性計(jì)算 1、組織中PDH活性計(jì)算: （1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 PDH活性（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL) （2） 按樣本鮮重計(jì)算 單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 PDH（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL)=905×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL) 2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞中PDH活性計(jì)算： （1）按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 PDH活性（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL) （2） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 PDH活性（U/104 cell）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷細(xì)菌或細(xì)胞密度(104 cell /mL)=905×ΔA÷細(xì)菌或細(xì)胞密度(104 cell /mL)

丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒