人白介素1α(IL-1α)分析檢測試劑盒檢測原理:

白細(xì)胞介素-1，簡稱白介素1(IL-1)，是一種細(xì)胞因子，屬于白細(xì)胞介素的一種。白細(xì)胞介素（interleukin，IL），簡稱白介素，是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子。白細(xì)胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。

白介素1(IL-1)是一種多肽，分子質(zhì)量為17ku，有 IL-1a 及 IL-1β 兩種亞型。IL-1a由159個氨基酸組成；IL-1β含153個氨基酸；兩者由不同的基因分別編碼。雖其氨基酸順序僅有26％的同源性，然而IL-1a和IL-1β以同樣的親和力結(jié)合于相同的細(xì)胞表面受體，發(fā)揮相同的生物學(xué)作用。

IL-1受體（IL-1r）IL-1r幾乎存在于所有有核細(xì)胞表面，每個細(xì)胞的IL-1r數(shù)目不等，少則幾十個（如t細(xì)胞），多則數(shù)千個（如成纖維細(xì)胞）。IL-1r主要有兩種類型：一種為IL-1r1，其分子伸入胞漿內(nèi)的肽鏈部分較長，起著傳

遞活化信號的作用；另一種為IL-1r2，胞內(nèi)部分的肽段較短，不能有效地傳遞信號，而是將胞外部分的肽鏈釋放到細(xì)胞外液中，以游離形式與IL-1結(jié)合，發(fā)揮反饋抑制作用。gm-csf、g-csf及IL-1自身均可提高細(xì)胞IL-1r的表達(dá)水平，而tgf及皮質(zhì)類固醇能降低IL-1r的表達(dá)。

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人IL-1α抗體包被于酶標(biāo)板上，實驗時樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的人IL-1α會與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IL-1α抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素?？谷薎L-1α抗體與結(jié)合在包被抗體上的人IL-1α結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，IL-1α濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中IL-1α的濃度。

樣品收集:

1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，

取上清檢測。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。

5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測

6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。

8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。 試驗所需自備物品:

1. 酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片)

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4. 吸水紙  

檢測前準(zhǔn)備工作:

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為250pg/mL）。然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906、0pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔0pg/mL。如配制125pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL250pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。  

4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當(dāng)日使用。

5. 酶結(jié)合物工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。

當(dāng)日使用。

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200μL/管）

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