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            ELI-SPOT 及其應(yīng)用

            閱讀:1468      發(fā)布時(shí)間:2013-6-19
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            一、            原理
            ELI-SPOT,即斑點(diǎn)ELISA,是利用酶標(biāo)板作反應(yīng)容器進(jìn)行的酶聯(lián)免疫反應(yīng)。其基本原理與ELISA相同。首先用捕獲抗體包被反應(yīng)板,封閉后,依次加入待檢標(biāo)本、生物素化檢測(cè)抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶及底物,陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)斑點(diǎn)顯色,利用倒置顯微鏡進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。其優(yōu)勢(shì)在于可在與體內(nèi)(活體條件)極接近的條件下,在體外對(duì)細(xì)胞分泌成分(如細(xì)胞因子、Fas等)進(jìn)行追蹤研究。
            幾點(diǎn)說(shuō)明:
            l        反應(yīng)板:ELI-SPOT所用的反應(yīng)板可以是PVDF膜包被好的,也可以是普通酶標(biāo)板。如用普通酶標(biāo)板,需用特制的瓊脂糖底物溶液。因此,ELI-SPOT又可分為PVDF法和瓊脂糖法。
            l        待檢標(biāo)本須制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)劑刺激后產(chǎn)生相應(yīng)的因子。
            l        細(xì)胞誘導(dǎo)方法:細(xì)胞誘導(dǎo)可分為直接法和間接法。如果細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程是在抗體包被的反應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行的,即為直接法;如果細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程是在24孔板或燒杯中進(jìn)行的,即為間接法。采用直接法還是間接法取決于以下幾個(gè)方面:?待分析細(xì)胞的類型。‚預(yù)期的能分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)。如果預(yù)期的可分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞量少,建議使用直接法;如果可分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞量特別高,用間接法。
            l        誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)時(shí)間的選擇:與待檢因子種類相關(guān),參照下表(廠家提供,僅供參考)
            待檢因子
            樣本來(lái)源
            誘導(dǎo)劑
            誘導(dǎo)時(shí)間
            檢測(cè)用細(xì)胞量
            Human IL-2
            PBMC
            PMA, Ionomycin
            10-15 hours
            5x104-1x105
            Human IL-4
            CD4+ T細(xì)胞
            PMA, Ionomycin
            10-15 hours
            2x105-2.5x105
            Human IL-6
            PBMC
            LPS
            10-15 hours
            1x104-2.5x104
            Human IL-10
            PBMC
            LPS
            20-24 hours
            2x105-2.5x105
            Human IL-12
            PBMC
            LPS
            Overnight
            1x105-2.5x105
            Human IFN-γ
            PBMC
            PMA, Ionomycin
            10-15 hours
            2x104-5x104
            Human TNF-α
            PBMC
            LPS
            10-15 hours
            2x104-4x104
            Human Fas L
            PBMC
            Anti-human CD3
            (B-B11), IL-2,
            / PMA,Ionomycin
            3days,10-15 hours
            3x105-4x105
            Murine IFN-γ
            PBMC
            PMA, Ionomycin
            10-15 hours
            2x104-5x104
            Rat IFN-γ
            PBMC
            PMA, Ionomycin
            10-15 hours
            2x104-5x104
            Rat TNF-α
            Rat splenocyte
            LPS
            10-15 hours
            2x104-4x104
             
            二、            ELI-SPOT 操作步驟
            APVDF
            1. 96孔PVDF包被板經(jīng)70%已醇處理后,用捕獲抗體進(jìn)行包被。
            2. 單細(xì)胞懸液(含適當(dāng)誘導(dǎo)劑)加入反應(yīng)孔內(nèi),孵育(直接法);如用間接法,細(xì)胞在24孔板或燒杯中誘導(dǎo)后,取適量誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞懸液加入到反應(yīng)孔內(nèi)。
            3. 倒掉細(xì)胞,加入生物素化檢測(cè)抗體,孵育。
            4. 加鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。
            5. 加入BCIP/NBT底物,形成斑點(diǎn)。
            B:瓊脂糖法
            1. 用捕獲抗體包被酶標(biāo)板。
            2. 單細(xì)胞懸液(含適當(dāng)誘導(dǎo)劑)加入反應(yīng)孔內(nèi),孵育(直接法)。如用間接法,細(xì)胞在24孔板或燒杯中誘導(dǎo)后,取適量誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞懸液加入到反應(yīng)孔內(nèi)。
            3. 倒掉細(xì)胞,加入生物素化檢測(cè)抗體,孵育。
            4. 鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。
            5. 加入瓊脂糖底物溶液,形成斑點(diǎn)。
             
            三、            ELI-SPOT 檢測(cè)單細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的意義
            細(xì)胞因子是一類由白細(xì)胞和其它一些細(xì)胞產(chǎn)生的,可在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞。大多數(shù)細(xì)胞因子是生長(zhǎng)或分化調(diào)節(jié)因子,通常在造血系統(tǒng)中發(fā)揮作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在腦、肌肉和內(nèi)分泌器官間也存在相互作用,另外,還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一些疾病中,如急性炎癥、血液病、癌癥和自身免疫性疾病中可常見(jiàn)細(xì)胞因子的異常表達(dá)。
            在單細(xì)胞水平進(jìn)行細(xì)胞因子的監(jiān)測(cè)提供了zui接近“原位”環(huán)境的,即zui接近體內(nèi)條件,觀察細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法。這正是ELI-SPOT方法的特性。它可使科研工作者在體外進(jìn)行與體內(nèi)環(huán)境相似的研究。利用這一方法,可跟蹤細(xì)胞因子的產(chǎn)生、跟蹤疾病進(jìn)展、調(diào)整臨床治療策略、防止病情惡化以及致命后果的發(fā)生。
             
            四、            ELI-SPOT應(yīng)用
            1. 在自身免疫腦脊髓炎疾病研究中,給大鼠注射干擾素β后,可顯著隆低可產(chǎn)生干擾素γ的細(xì)胞的數(shù)量。(1)
            2. 進(jìn)行免疫基因肽疫苗的評(píng)價(jià)。(2)
            3. 接種途徑效果的評(píng)估。(3)
            4. 研究TH1/TH2 T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的方式以及由一個(gè)亞群向另一個(gè)亞群轉(zhuǎn)換的情況。(4,5)
            5. 成功檢測(cè)黑色素瘤中腫瘤活性T細(xì)胞數(shù)量。(6)
            6. 用于重癥肌無(wú)力患者外周血IFN-γ、IL-10分泌性T細(xì)胞的研究。(7)
             
            五、            參考文獻(xiàn):
            1. Ruuls, S.R. et al., 1996  J. Immunol. 157:5721
            2. Kulane, A. et al., 1997  Acta Tropica. 68:37
            3. Ibsen, M. W. et al., 1997  Scand. J. Immunol. 46:274
            4. Gabrielsson, S. et al., 1997  Allergy. 52:860
            5. Elaghazali, G. et al., 1997  Clin. Exp. Immunol. 109:84
            6. Scheibenbogen, C. et al. 1997  Int. J. Cancer 71:932
            7. 侯世芳,閆曉波,王維治,1999  第六屆全國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編

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