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用SPEX 組織研磨儀高通量破碎96孔板中的酵母菌
閱讀：3339發(fā)布時間：2016-7-26
多年生化、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究成果已經(jīng)使得酵母菌成為一種的基因表達研究和蛋白質(zhì)重組表達的通用宿主，成為生物系統(tǒng)研究的模式型生物，是生物制藥科學(xué)家的有力工具。盡管包括Pichia、Hansenula、Debaryomyces均被研究者所使用，但使用zui普遍的依然是Saccharomyces酵母。
酵母菌mRNA 和細胞內(nèi)蛋白，很難用傳統(tǒng)酶解方法完整提取。裂解酶中通常含有核糖核酸酶和其他蛋白酶，它們不僅會破壞細胞壁，且會破壞特定分子。另外，酶解產(chǎn)生的原生質(zhì)體，需借助特定試劑進行溶解，而導(dǎo)致很多蛋白質(zhì)變性失活。因此常常需要使用物理方法破碎酵母菌，從而釋放內(nèi)容物。
通常的壓榨或球磨方式，每次只能處理一個樣品，操作效率太低。對于那些需要進行高通量篩選檢測酵母菌的實驗，單個處理是一個主要的瓶頸和不切實際的，所以我們就需要一種可以單次高通量裂解細胞的方法。Geno/Grinder組織研磨儀——一個zui初是為了在深孔板中高通量破碎種子而設(shè)計的垂直振蕩研磨儀就可以很好的解決這一問題。可同時在6個96孔深孔板中對酵母菌進行破碎。實現(xiàn)高通量地裂解酵母。
材料和方法：
釀酒酵母在YPD培養(yǎng)基（(1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖)）中30°C下150 rpm振蕩培養(yǎng)一整夜，使用無菌96孔板（CorningLife Science），每個孔中加入100 ml 培養(yǎng)液和酸洗的玻璃珠(Sigma,G-8772)。使用一系列不同尺寸的玻璃研磨珠（106 目 (非常小),150-212 目,212-300 目,425-600 目(大).）對照組酵母菌中只加入培養(yǎng)液不加玻璃研磨珠。蓋上橡膠密封墊密封后放入Geno/Grinder動植物組織研磨機內(nèi)，固定好。 1500轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩5-10分鐘。完成后，用相差顯微鏡檢查酵母培養(yǎng)物并拍照。
結(jié)果和討論：
酵母裂解的有效性取決于玻璃珠的大小和研磨持續(xù)的時間。圖1-3是用425-600目玻璃珠振蕩5-10分鐘的細胞裂解的效果。在裂解細胞時，玻璃珠的目數(shù)越低效果更差，106目的玻璃珠尤其沒有效果。結(jié)果表明425-600目的玻璃珠是裂解Saccharomyces的。
Geno/Grinder組織研磨儀的*設(shè)計也是裂解過程中一個重要的因素。標準的珠磨研磨機適應(yīng)微孔板的應(yīng)用模仿“油漆攪拌器”設(shè)計，呈8字形運動。這種運動方式不能使樣品得以均一的裂解，樣品間差別很大。而Geno/Grinder的垂直振蕩模式則能有效的裂解多孔材料中的樣品，這種上下垂直運動方式使得玻璃珠更直接的碰撞細胞（而不會像一般的珠磨除了碰撞細胞外也常常會碰撞孔壁），從而能夠得到均一的研磨效果。
圖1. 對照組未加玻璃珠的酵母菌。10分鐘后，這些酵母菌依然完好無損。
圖2. 用425-600目玻璃珠振蕩5分鐘的細胞裂解的效果。破碎的酵母像是黑暗的“鬼魂”，完整的酵母菌則繼續(xù)折射光而呈現(xiàn)出明亮的部分。
圖3. 用425-600目玻璃珠振蕩10分鐘的細胞裂解的效果。絕大多數(shù)酵母菌已經(jīng)破碎呈現(xiàn)出黑暗的細胞“鬼魂”陰影，極少幾個酵母菌沒有被振蕩破碎而呈現(xiàn)出明亮的部分。
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