您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
免疫共沉淀實驗·基礎(chǔ)篇
What is Co-IP？
Co-IP全稱Co-Immunoprecipitation，中文學(xué)名免疫共沉淀，是一種以抗體和抗原識別專一性為基礎(chǔ)，用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法。
通俗點來說，假設(shè)我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用，首先我們通過合適的方法處理樣本，將蛋白提取出來（同時不能破壞蛋白之間的相互作用），然后用預(yù)先結(jié)合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白，那么與A蛋白結(jié)合的B蛋白也能一起沉淀下來。再將蛋白從珠子上裂解下來，對B蛋白進行檢測，能檢測到，說明B蛋白在之前的沉淀過程中隨著A蛋白一起被拉下來了，進而證明二者之間存在相互關(guān)系。
How to do？
實驗流程
A few tips：
如何理解文獻(xiàn)中的結(jié)果？
各名稱解析：
IB：全稱immunoblotting，即免疫印跡，也就是常規(guī)的Western Blotting，用于顯示目的蛋白。
IP：全稱immunoprecipitation，即免疫沉淀，這一步主要是為了純化富集目的蛋白。
Input：全細(xì)胞裂解液，含有細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白，可認(rèn)為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細(xì)胞裂解液，在做IP實驗之前，需要先跑WB，確認(rèn)樣本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗體
IgG：Anti-A的同型對照抗體，即跟Anti-A同來源同種型，如Anti-A是兔來源IgG型，則同型對照抗體需要選擇Rabbit IgG（abs20035）
結(jié)果圖解析：
該結(jié)果是為驗證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用。本實驗一共分為兩大組：Input組及IP組，其中IP組又分為IgG組（陰性對照組）和實驗組，并通過WB去驗證蛋白A和B在每一個組里面是否存在。由Input組的條帶可以得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B都是存在的，證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。陰性對照IgG組和實驗組平行進行免疫沉淀實驗，結(jié)果蛋白A與蛋白B均沒有條帶，說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來，證明蛋白A和B與IgG沒有結(jié)合，排除了蛋白與抗體非特異性結(jié)合的可能性；而實驗組蛋白A和B均有條帶，表示利用蛋白A的抗體進行沉淀實驗，成功把蛋白A沉淀下來了，與此同時蛋白B也被沉淀下來，進而得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B之間存在相互作用。
試劑盒寫著50T，意思是能做50次Co-IP實驗？
確切來說，試劑盒的50T代表著能夠完成50次免疫沉淀反應(yīng)，而實際上免疫共沉淀實驗需要設(shè)置多個組別進行對照驗證，因此具體能夠完成多少次Co-IP實驗由設(shè)計方案決定，一般至少需要設(shè)置陰性對照、陽性對照、實驗組三個組別。
預(yù)清除步驟的作用是什么？必須要進行嗎？
這個步驟的目的是為去除樣本中可與protein A/G瓊脂糖珠非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，減少干擾，非必做，如CoIP實驗中發(fā)現(xiàn)有較多雜帶，可考慮做一下；但應(yīng)注意，選擇此步驟后，需要消耗瓊脂糖珠，后續(xù)能夠進行免疫沉淀的次數(shù)也相應(yīng)減少。
陰性對照IgG組出現(xiàn)條帶是什么原因？
首先需要排除lgG和后續(xù)WB一抗同源導(dǎo)致的輕重鏈的干擾條帶（25kd和50kd附近）；再者建議進行預(yù)清除實驗以排除Protein A/G的非特異性結(jié)合；再就是考慮lgG的問題可以換用其他品牌lgG嘗試。
出現(xiàn)假陽性結(jié)果該怎么排除？
假陽性結(jié)果需要設(shè)置對應(yīng)的陰性對照組一一排除，假設(shè)實驗組為瓊脂糖珠+抗體X+靶蛋白X+抗體Y+目的蛋白Y：
| 可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果的成因 | 對照組設(shè)置 |
| 瓊脂糖珠與X蛋白發(fā)生非特異結(jié)合 | 瓊脂糖珠+抗體X+抗體Y |
| 瓊脂糖珠與Y蛋白發(fā)生非特異結(jié)合 | 瓊脂糖珠+蛋白Y |
| 抗體X和目的蛋白Y非特異性結(jié)合 | 瓊脂糖珠+抗體X+蛋白Y |
| 抗體的非特異性結(jié)合 | IgG+蛋白X+蛋白Y |
最后的實驗結(jié)果是陰性的，是否能說明兩個蛋白之間無相互作用？
對于內(nèi)源性Co-IP實驗，陰性結(jié)果不能說明無相互作用，也有可能是蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)過低導(dǎo)致，因此建議先做過表達(dá)Co-IP作為對照。
IP&WB全套試劑清單推薦
| 貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 貨期 |
| abs955 | 免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒 | 50tests | 現(xiàn)貨 |
| abs9146 | PMSF | 5g/25g/100g | 現(xiàn)貨 |
| abs9116 | Lysis Buffer for WB/IP Assays | 100ml | 現(xiàn)貨 |
| abs9239 | Lysis Buffer for WB/IP Assays (Without Enzyme Inhibitors) | 100ml | 現(xiàn)貨 |
| abs20035 | Rabbit IgG | 10mg | 現(xiàn)貨 |
| abs20038 | Mouse IgG | 1mg | 現(xiàn)貨 |
| abs9232 | BCA蛋白定量試劑盒 | 500次 | 現(xiàn)貨 |
| abs9389 | BIS-Tris Gels 預(yù)制膠10%, 10 wells | 10片/盒 | 現(xiàn)貨 |
| abs924 | 預(yù)染蛋白marker, 10-180kDa | 2*250ul | 現(xiàn)貨 |
| abs950 | 10*電轉(zhuǎn)液 | 1L | 現(xiàn)貨 |
| abs954 | WB專用一抗二抗稀釋液 | 100ml | 現(xiàn)貨 |
| abs961 | 10×PBS緩沖液 | 500ml | 現(xiàn)貨 |
| abs952 | 10*TBST | 1L | 現(xiàn)貨 |
| abs9157 | 牛血清白蛋白 (BSA) | 100g | 現(xiàn)貨 |
| abs920 | ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒 | 2*25ml | 現(xiàn)貨 |
| More....... | |||
上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司
試劑 | 耗材 | 儀器 | 軟件 | 定制 | 實驗服務(wù) | 供應(yīng)鏈
微信公眾平臺：優(yōu)寧維抗體專家，歡迎關(guān)注！
小優(yōu)博士（小程序）：5大課堂, 讓你的科研不再難！
