您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
噻唑蘭
英文名稱： MTT
中文名稱： 噻唑蘭
MF： C18H16BrN5S
MW： 414.32
CAS： 298-93-1
實(shí)驗(yàn)方法明確問題
⒈選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
⒉藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
⒊ 時間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，zui后得到不同時間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點(diǎn)應(yīng)該就是的時間點(diǎn)（因?yàn)檫@個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的zui明顯）。
⒋培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。
⒌MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。
⒍理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。
⒎實(shí)驗(yàn)時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。
⒏避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。步驟把握
MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT 吸光度在0-0.7 范圍內(nèi)。
MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心，有條件帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.
配制MTT時用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
調(diào)pH 7.4
定容1L
MTT用途及原理
MTT主要有兩個用途：
1．藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定；MTT原理：
檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。
貼壁細(xì)胞
1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
⒉、5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況
⒊、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜） mtt
懸浮細(xì)胞
1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲存液100mg/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ml 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4，直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）
4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。
接種（鋪板)
細(xì)胞過了30代以后就不要用了，因?yàn)闋顟B(tài)不好了；培養(yǎng)板要用好的（進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。
接種時按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種，因?yàn)榧?xì)胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系，結(jié)果zui可信。如果鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會很明顯，太密細(xì)胞可能都會凋亡，因?yàn)榧?xì)胞長的太快營養(yǎng)會不夠，zui后導(dǎo)致死亡。且而細(xì)胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來定.如果你做的藥品對細(xì)胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞濃度，如果你做的藥品對細(xì)胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞濃度，這樣與對照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105，貼壁細(xì)胞可為103-104.
其它的聲音
⒈首先細(xì)胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細(xì)胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，*點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。
⒉MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20%的波動也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過關(guān)。
⒊我做的是腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)，這種細(xì)胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的，結(jié)果細(xì)胞長的太滿結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關(guān)系.后來調(diào)整濃度，用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點(diǎn)的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組，由于細(xì)胞少，藥物作用的梯度還是有，只是沒有很好的線性關(guān)系.還有根據(jù)細(xì)胞生長速度以及藥物的特性（有時間依賴性和濃度依賴性的藥物）來確定培養(yǎng)時間是48小時還是72小時.
注意細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞活力。所以要熟練些、快些上板。
2．細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。