粒徑控制對脂質(zhì)體載藥的重要作用及相關(guān)檢測方法

摘要：脂質(zhì)體作為藥物載體，控制其粒徑大小是必要的。動態(tài)光散射法和單顆粒光學(xué)傳感技術(shù)可分別對亞微米、微米級別的粒徑進(jìn)行分析，美國藥典中對粒徑分布有明確的規(guī)定。通過實驗驗證了美國PSS公司的Nicomp 380/ZLS激光粒徑檢測儀、AccuSizer 780A光學(xué)粒徑檢測儀的結(jié)合使用，可以對粒徑進(jìn)行更科學(xué)的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：脂質(zhì)體；粒徑分布；檢測方法；USP729；PFAT5

一、脂質(zhì)體的簡介

脂質(zhì)體 (liposome)的藥劑學(xué)定義，是指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體。脂質(zhì)體的主要類型有單層小泡(SUV)、小多層小泡(SMV)、多層小泡(MLV)、大單層小泡(LUV)和巨型多層小泡(GMV)。脂質(zhì)體是*被成功應(yīng)用于臨床的納米藥物輸送系統(tǒng)，脂質(zhì)體的大小和載藥量在藥物的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)參數(shù)中起著關(guān)鍵作用。因此，和快速的測量脂質(zhì)體的大小是重要的新型和有效的給藥系統(tǒng)。

二、脂質(zhì)體粒徑的檢測方法

脂質(zhì)體的粒徑通常采用動態(tài)光光散射法（Dynamic Light Scattering, DLS）及單顆粒光學(xué)傳感技術(shù)（Single Particle Optical Sensing, SPOS）。動態(tài)光散射法是測定亞微米脂質(zhì)體大小常用的分析技術(shù)，單顆粒光學(xué)傳感技術(shù)(SPOS)用于測量大于1μm的脂質(zhì)體的大小。

三、脂質(zhì)體粒徑的控制

Maryam Amidi, Markus de Raad等人^[1]進(jìn)行了抗原表達(dá)免疫刺激脂質(zhì)體的相關(guān)研究，該研究使用脂質(zhì)體作為人工接種微生物，這些人工微生物可以通過基因編程隨心所欲地產(chǎn)生特定的抗原。將細(xì)菌體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)以及編碼模型抗原b-半乳糖苷酶的基因構(gòu)建包埋在多層脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體的體積加權(quán)平均直徑和大小分布由單顆粒光學(xué)傳感(Accusizer^TM 780, Santa Barbara, California, USA)測定。β-半乳糖苷酶脂質(zhì)體和AnExIL（表達(dá)抗原的免疫刺激脂質(zhì)體）制劑的體積加權(quán)平均粒徑約為1.5 μm。研究表明^[2]，粒徑在20~200nm之間的脂質(zhì)體是局部應(yīng)用藥物通過細(xì)胞間滲透途徑進(jìn)入活表皮的活性載體。

楊艷芳、謝向陽等人^[3]對于粒徑與表面電荷影響脂質(zhì)體體內(nèi)藥物靶向遞送進(jìn)行了相關(guān)的探討，粒子大小在100nm以內(nèi)具有高透膜性，100~200nm的具有較高的透膜性。納米粒子的透膜性隨其粒徑的增加而減少，被動轉(zhuǎn)運膜的粒徑臨界值為500nm，大于500nm的粒子很難跨越極性上皮細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。粒徑為500nm~10μm的固體顆粒均可被吞噬性細(xì)胞所攝取，且細(xì)胞吞噬作用隨其粒徑的增大而增強(qiáng)^[4,5]。

脂質(zhì)體的粒徑同樣也影響脂質(zhì)體對腫瘤組織的靶向性。脂質(zhì)體的粒徑必須大于10nm, 以避免腎臟濾過效應(yīng)。脂質(zhì)體可以發(fā)生EPR效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，增加的滲透性和保留效應(yīng)）的粒徑由多個因素決定。作為被動靶向, 其依賴于擴(kuò)散調(diào)節(jié)的藥物運輸機(jī)制。Dreher等^[6]報道, 粒徑為幾百納米的粒子容易在腫瘤組織中累積，獲得EPR效應(yīng)的脂質(zhì)體沉積的粒徑上限為400nm，大于400nm的脂質(zhì)體不能擴(kuò)散通過腫瘤間隙。腫瘤血管開孔的孔徑在50~100nm，是限制脂質(zhì)體滲透進(jìn)入腫瘤組織的重要途徑。綜合來說，脂質(zhì)體通過EPR效應(yīng)在腫瘤組織積聚的有效粒徑范圍為10~150nm。

四、粒徑控制的重要性

乳劑的平均粒徑分布和粒度大小與有效性和安全性有直接關(guān)聯(lián)^[7]。在醫(yī)藥行業(yè)，注射劑中的大顆粒會伴隨著注射過程進(jìn)入人體肺部，造成肺部肉芽腫（美國曾經(jīng)發(fā)生過大粒子引起的醫(yī)療事件，這是促成美國藥典委員會對大粒子關(guān)注的起因）。且乳劑中大粒子的存在會加速乳滴的聚集作用，會造成乳滴的絮凝，凝結(jié)，出現(xiàn)相分離現(xiàn)象。一般來說，乳劑的粒徑保持在0.2~0.5μm可以保持*物理穩(wěn)定性^[8]，且易被人體吸收。而人肺部的毛細(xì)血管在4μm~9μm之間，若脂肪乳含有大于5μm的粒子，或者粒子不夠穩(wěn)定，在放置過程中有可能合并成為大于5μm的粒子，就會在肺部發(fā)生栓塞，且大粒子對肝臟產(chǎn)生損傷。因此脂肪乳注射液質(zhì)量控制關(guān)鍵要控制平均粒徑（小于0.5μm）和大于5μm粒子的比例。

五、粒徑的分析

中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院的潘偉祥、劉潔等人^[9]利用了美國Particle Sizing Systems公司的Nicomp 380/ZLS激光粒徑檢測儀、AccuSizer 780A光學(xué)粒徑檢測儀對前列地爾注射液配伍實驗中乳粒穩(wěn)定性進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，動態(tài)光散射法適用于測量乳粒的平均粒徑，而光消減-單粒子光學(xué)傳感法是評價大粒子粒徑分布更為有效的方法，因此建議采用2種方法相結(jié)合，從而對乳劑的粒徑進(jìn)行更科學(xué)的質(zhì)量控制(包括平均粒徑和大粒子)。

圖1. Nicomp 380/ZLS對某乳劑樣品的光強(qiáng)徑高斯分布譜圖

圖2. AccuSizer 780對某乳劑樣品分析的粒徑-數(shù)量分布圖

圖1顯示的是Nicomp 380/ZLS激光粒徑檢測儀對某乳劑樣品分析的光強(qiáng)徑高斯分布譜圖，由圖1可知該乳劑的平均粒徑約為908nm；圖2顯示的是AccuSizer 780A光學(xué)粒徑檢測儀對某乳劑樣品分析的粒徑-數(shù)量圖譜，可知不同粒徑粒子的分布及其數(shù)量。兩種方法結(jié)合分析，可以更好的控制顆粒的質(zhì)量。

六、美國藥典<USP>對粒徑檢測要求的變化

2004年10月，美國藥典在的USP<729>章節(jié)中公布了脂肪乳粒度測試要求，方法一采用動態(tài)光散射或者米氏散射原理測試脂肪乳的平均粒徑，規(guī)定強(qiáng)度值（Int-Weight）；方法二采用光阻法統(tǒng)計1.8μm-50μm的脂肪乳顆粒體積在油相體積中的比例（PFAT5） 值不得超過0.05%，有了對尾端大粒子明確的規(guī)定。

2007年11月USP<729>在方法一中做了變動，對于脂質(zhì)體注射劑中的整體粒徑分布進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，無論乳劑樣品的濃度如何，用于注射乳劑的平均光強(qiáng)粒徑要小于500nm或0.5μm。

2010年USP<729>在方法二中延長了測試時間，運行兩次樣品，PFAT5值均不得超過0.05%。

2013年11月，USP<729>的內(nèi)容規(guī)定脂肪乳乳滴平均粒徑分布采用動態(tài)光散射原理，尾端大于5μm的乳滴（PFAT5）占油相體積比例采用光阻法測定，明確規(guī)定了顆粒粒度分布的檢測方法。

參考文獻(xiàn)

[1] Maryam Amidi, Markus de Raad, Daan J. A. Crommelin, etal. Antigen-expressing immunostimulatory liposomes as a genetically programmable synthetic vaccine[J]. Syst Synth Biol, 2011, 5:21-31.

[2] Egbaria K, Weiner N. Liposomes as a topical drug delivery system[J]. Adv Drug Del Rev 1990; 5:287–300.

[3] 楊艷芳，謝向陽，楊陽等。粒徑與表面電荷影響脂質(zhì)體體內(nèi)藥物靶向遞送的研究進(jìn)展 [J]。藥學(xué)學(xué)報, 2013, 48(11)：1644-1650。

[4] Groves E, Dart AE, Covarelli V, et al. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells[J]. Cell Mol Life Sci, 2008, 65:1957-1976.

[5] Champion JA, Mitragotri S. Role of target geometry in phagocytosis[J]. Proc Natl USA, 2006, 103:4930-4934.

[6] Dreher MR, Liu W, Michelich, CR, et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers [J]. J Natl Cancer Inst, 2006, 98: 335-344.

[7] Shibata H, Saito H, Yomota C, et al. Pharmaceutical quality evaluation of lipid emulsions containing PGE1: alteration in the number of large particles in infusion solutions [J]. Int J Pharm, 2009, 378(1): 167-176.

[8] CU LLAR I, Bull NJ, Forgarini AM, et al. More efficient preparation of parenteral emulsions or how to improve a pharmaceutical recipe by formulation engineering[J]. Che Eng Sci, 2005, 60 (8-9): 2127 -2134.

[9] 潘偉祥，劉潔，何軍等。前列地爾注射液配伍試驗中乳粒穩(wěn)定性的探討[J]。Chinese J. of New Drugs, 2013, 22 (18) 。