接上篇有了這份秘籍，您的液相色譜還會老出問題嗎？(一)
三、流動相(MOBLLE PHASE)的問題
甲醇和乙腈在高效液相色譜分析法中常常被用來配制流動相。高效液相色譜法中常用的試劑最好是高等級的專用試劑，如色譜純試劑。在要求不太嚴(yán)格時，優(yōu)級純甚至分析純的試劑也能用。高效液相色譜分析法中常用的是紫外檢測器，因此，從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來考慮，應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純試劑。
1、流動相的過濾
配制好的流動相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來過濾。這是因?yàn)槿芤褐泻泻芏嗳庋垭y以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒，如果不把它們?yōu)V除掉，就會堵塞泵口、柱頭上的過濾器，這樣就堵塞了流動相的正常通道，使色譜柱的阻力增加，柱壓升高，柱效下降。碰到這種情況時，要換用經(jīng)過濾的流動相，并將堵塞的濾器拆下來浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機(jī)清洗20分鐘，以除去濾片上的堵塞物。
2、流動相的脫氣
流動相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動相中的氣體，否則，這些氣體會使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測器的信號產(chǎn)生很大的干擾。脫氣有多種方法，如超聲脫氣、真空脫氣、氮?dú)饷摎獾?。真空脫氣法和氮?dú)饬髅摎夥?。水和甲醇混合后會產(chǎn)生大量的氣泡，如果不脫氣就使用，氣泡就會進(jìn)入色譜柱和檢測器，并將影響分析工作的正常進(jìn)行。
四、色譜柱的使用和保養(yǎng)
色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件，被測物質(zhì)能否被很好的分離和測定，色譜柱的性能起著決定性的作用。因此，在日常工作中，應(yīng)特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng)，以延長色譜柱的使用壽命。
1、使用預(yù)柱和保護(hù)柱
預(yù)柱(pre-column)安裝于泵和進(jìn)樣器之間，它給色譜柱中的流動相提供了*的平衡，并防止了對柱填料有破壞作用的組分或污染物進(jìn)入色譜柱。保護(hù)柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進(jìn)入色譜柱，保護(hù)柱應(yīng)與色譜柱的填料相同。預(yù)柱和保護(hù)柱可以經(jīng)常更換，而不需要經(jīng)常更換色譜柱，這就延長了色譜柱的使用壽命。
2、防止氣體進(jìn)入色譜柱
有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進(jìn)入的，否則將會使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此，為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱，一定要使用經(jīng)過脫氣的流動相，并且要嚴(yán)格按照下列步驟來安裝色譜柱：
a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出；
b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進(jìn)入；
c.如無溶劑滲出時，表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了，此時，可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上，以流動相來反方向沖洗色譜柱，以便將柱內(nèi)的空氣排除。最好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會導(dǎo)致柱性能的降低；
d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了。
3、色譜柱的清洗
為了不使被測物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后，都應(yīng)及時地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑來洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì)，此時應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動相是緩沖溶液，則應(yīng)先用蒸餾水來沖洗色譜柱，以沖掉柱內(nèi)的鹽，然后再用合適的溶劑來沖洗。
凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相，用完之后當(dāng)然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續(xù)操作，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過夜，但最好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。
4、色譜柱的存放
如果色譜柱暫時不用，存放時要注意以下幾點(diǎn)：
a.幾天之內(nèi)的短期放置，應(yīng)先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來沖洗)，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。
b.如果色譜柱長期不用，僅用上述方法來處理就不行了，這時應(yīng)使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱則可用正已烷或庚烷，而凝膠柱則不能用水了，因柱內(nèi)如果有微生物的生長則會使柱效降低，此時應(yīng)用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴(yán)。色譜柱長期放置時，一定要將色譜柱的兩端封嚴(yán)，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象，因這可導(dǎo)致柱效的嚴(yán)重降低。
c.色譜柱應(yīng)貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環(huán)境里，柱內(nèi)就會結(jié)冰，這也將導(dǎo)致柱效的降低。
五、色譜峰的雙峰問題
長期使用后的色譜柱，如果有雜質(zhì)進(jìn)入，就會使色譜柱入口處的固定相“板結(jié)"并在流動相所產(chǎn)生的高壓作用下，形成柱頭的塌陷，被分析的樣品組分的正常色譜峰就變成了雙峰，這時可按下述方法來修復(fù)色譜柱。首先將柱頭的緊固螺母旋下，這時就會發(fā)現(xiàn)柱頭內(nèi)的固定相已被壓縮進(jìn)去了，嚴(yán)重時可縮進(jìn)10mm以上。在這種情況下，我們可用針尖將流動相表層板結(jié)變黃的部分摳掉，并以相同的固定相將此塌陷區(qū)填平、壓實(shí)，再將色譜柱的緊固螺絲上緊，修復(fù)工作即告結(jié)束。用經(jīng)過修復(fù)后的色譜柱再做樣品時，色譜峰就恢復(fù)正常了。
以上從幾個方面簡介了色譜儀的正確使用及故障排除方法。在日常工作中，如果能對這些事項(xiàng)認(rèn)真對待，做到有問題及時解決，則會大大延長儀器的正常使用期限，并使儀器的性能得到最大限度的發(fā)揮。
