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光遺傳系統(tǒng)的試驗(yàn)操作方法分享
光遺傳系統(tǒng)利用分子生物學(xué)、病毒生物學(xué)等手段，將外源光敏感蛋白基因?qū)牖罴?xì)胞中，在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上表達(dá)了光敏感通道蛋白；然后通過特定波長光的照射，控制細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的光敏感通道蛋白的激活與關(guān)閉；光敏感蛋白的激活和關(guān)閉可控制細(xì)胞膜上離子通道的打開與關(guān)閉，進(jìn)而改變細(xì)胞膜電壓的變化，如膜的去極化與超極化。
光遺傳系統(tǒng)技術(shù)通過一定波長的光對細(xì)胞進(jìn)行選擇性地興奮或者抑制，達(dá)到控制特定類型細(xì)胞活動的目的。光遺傳學(xué)技術(shù)對細(xì)胞的選擇性目前主要通過三種方法實(shí)現(xiàn)：
通過病毒載體直接選擇性表達(dá)光感基因。相比轉(zhuǎn)基因動物，病毒載體具有很多優(yōu)勢，包括：制備周期短，從載體克隆到病毒表達(dá)只需要數(shù)周時間就可以完成；可用于難以轉(zhuǎn)基因的動物，如靈長類等；病毒表達(dá)只局限于注射位點(diǎn)，如某個特定的腦區(qū)，因此具有空間選擇性；某些病毒具有天然嗜性，只感染一些特定的細(xì)胞類型等。目前廣泛用于光遺傳學(xué)研究的病毒載體是慢病毒和腺相關(guān)病毒載體。
病毒注射常見問題解析：
病毒保存：病毒-80分裝儲存，避免反復(fù)凍融，4度保存建議不超過一周。使用過程中病毒置于冰上或放在4度冰箱，盡量減少在室溫的放置時間。
病毒稀釋：無菌PBS或生理鹽水稀釋均可，稀釋后盡量一次用完。
病毒注射針尖堵住的處理方法：首先使用生理鹽水棉球擦拭針尖，注射泵快推后針尖仍堵住則要剪掉部分電極。
確定注射到腦組織：觀察玻璃電極內(nèi)病毒與液體石蠟接觸液面分層是否下降。
病毒較多漏到目標(biāo)腦區(qū)上方核團(tuán)的原因：注射完停針時間不夠，原則上不少于10min；注射速度較快，建議注射速度選擇10-30nl/min，注射時間控制在10min為宜。
根據(jù)目標(biāo)核團(tuán)、病毒滴度、病毒種類和功能元件大小確定注射量。