導(dǎo)語：搖瓶的使用對動物細胞的培養(yǎng)越來越重要。以下各種搖瓶中培養(yǎng)CHO（中國倉鼠卵巢）細胞的示例表明，Multitron細胞培養(yǎng)搖床（INFORS HT，CH Bottmingen）非常適合種子液的生產(chǎn)。
1. 簡介
搖瓶的使用對動物細胞的培養(yǎng)越來越重要。以下各種搖瓶中培養(yǎng)CHO（中國倉鼠卵巢）細胞的示例表明，Multitron細胞培養(yǎng)搖床（INFORS HT，CH Bottmingen）非常適合種子液的生產(chǎn)。
CHO細胞系是生物技術(shù)中常用的細胞系。為了生產(chǎn)用于接種的種子培養(yǎng)液和生產(chǎn)SEAP蛋白，使用了CHO-XM-111細胞株。瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院 M.Fussengerger 教授的團隊用編碼重組蛋白SEAP（分泌型堿性磷酸酶）基因的表達載體轉(zhuǎn)染該細胞株，并使用由四環(huán)素控制的啟動子PhCMV-1。表達載體的使用使得通過啟動子可選擇性表達兩個基因成為可能。這樣就可以生產(chǎn)SEAP蛋白，包括非生產(chǎn)性的生長階段，和基于無四環(huán)素培養(yǎng)基交換的增殖抑制生產(chǎn)階段。
2. Multitron 技術(shù)參數(shù)
* 50 mm 振幅 (可選25mm)
* 通氣 空氣和 CO2 (0 – 20% asstandard)
* 蒸汽濕度套件（可選）
* 不同可選托盤 (一次培養(yǎng)袋托盤, 粘性托盤，通用托盤等)
* 其他選項 (制冷, 去污, ShakerBag等)
3. 實驗條件
為了在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)種子培養(yǎng)液（作為后期培養(yǎng)的接種物）和SEAP，使用CHO-XM-111細胞系，無血清和無蛋白的HP-1培養(yǎng)基（Cell Culture Technologies GmbH）在250 mL、500 mL和1000mL搖瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中添加2g/L Pluronic F-68（Sigma）和2.5 mg/L 四環(huán)素（Sigma）。設(shè)置溫度37℃，濕度85% 和5%的CO2飽和度。所有搖瓶以恒定的122 rpm轉(zhuǎn)速在Multitron（INFORS-HT, CH-Bottmingen）中培養(yǎng)。
4. 批次補料振蕩培養(yǎng)
采用不同體積的搖瓶和相應(yīng)的補料策略。
a) 在250ml搖瓶中的培養(yǎng)過程按照以下模式進行：
| 天/小時 – 步驟 | 體積（mL） | 每毫升細胞濃度 | 存活百分比 |
| 0 d/0 h – 接種 | 50 | 3.0 x 105 | 86.9 |
| 1 d/21 h – 補料 | 50 (+ 30 mL) | 6.6 x 105 | 91 |
| 2 d/43 h | 80 (max. 32%) | 1.95 x 106 | 97.4 |
| 3 d/67 h | 80 | 2.25 x 106 | 98.3 |
| 4 d/91 h | 80 | 1.95 x 106 | 98.7 |
最大比生長速率μmax為0.048 h-1，倍增時間td =14.4h。
圖1: Multitron
b) 在500ml搖瓶中的培養(yǎng)過程按照以下模式進行：
| 天/小時 – 步驟 | 體積（mL） | 每毫升細胞濃度 | 存活百分比 |
| 0 d/0 h – 接種 | 100 | 7.8 x 105 | 95.5 |
| 1 d/24 h – 補料 | 100 (+ 50 mL) | 1.88 x 106 | 98.7 |
| 2 d/47 h – 補料 | 150 (+ 50 mL) | 2.18 x 106 | 99.1 |
| 3 d/67 h – 更換培養(yǎng)基 | 250 (+ 50 mL) | 2.33 x 106 | 99.3 |
| 4 d/91 h | 300 (max. 60%) | 2.63 x 106 | 99.7 |
| 5 d/115 h | 300 | 4.65 x 106 | 99.4 |
| 6 d/139 h | 300 | 3.90 x 106 | 98.1 |
| 7 d/163 h | 300 | 2.55 x 106 | 81.8 |
最大比生長速率μmax為0.024 h-1，倍增時間td =28.9h。
c) 在1000ml搖瓶中的培養(yǎng)過程按照以下模式進行：
| 天/小時 – 步驟 | 體積（mL） | 每毫升細胞濃度 | 存活百分比 |
| 0 d/0 h – 接種 | 150 | 6.6 x 105 | 98.9 |
| 1 d/23 h – 補料 | 150 (+ 50 mL) | 9.6 x 105 | 98.9 |
| 2 d/45 h – 補料 | 200 (+ 50 mL) | 1.95 x 106 | 99 |
| 3 d/66 h – 補料 | 250 (+ 50 mL) | 1.10 x 106 | 99.3 |
| 4 d/93 h | 300 | 2.18 x 106 | 99.4 |
| 5 d/117 h – 15-fold dilution | 400 (max. 40%) | 2.25 x 106 | 98.5 |
| 8 d/189 h | 400 | 1.40 x 106 | 66.9 |
最大比生長速率μmax為0.044 h-1，倍增時間td =15.65h。
d) 蒸汽加濕
為了檢測每日液體損失，使用125 mL搖瓶，工作體積為15 mL、20 mL和25 mL，在溫度為37°C，濕度為85% rH的培養(yǎng)前后測定總體積。
5. 分析
a) 參數(shù)分析
每天使用細胞計數(shù)器yc100（Chemotec）測定活細胞濃度。使用Bioprofile Analyzer 100 Plus（Nova Biomedical）完成生長和生產(chǎn)基質(zhì)的分析
b)公式
對于最大生長速率μmax和倍增時間td的計算，使用以下公式。
6. 結(jié)果分析
為了優(yōu)化CHO種子液培養(yǎng)，在Multitron細胞培養(yǎng)搖床中設(shè)置了三個不同體積的搖瓶（250ml、500ml和1000ml）。在培養(yǎng)CHO-XM-111細胞的同時，每天取樣檢測，從而可以**地比較細胞濃度、底物消耗和緩沖液。
對比最大細胞濃度表明，500ml 搖瓶中的培養(yǎng)物每毫升可產(chǎn)生4.65×106個細胞。在所有培養(yǎng)物中，6天內(nèi)可達到98%以上的存活率。通過優(yōu)化補料策略，種子培養(yǎng)可在2天后進行，最多5天（圖2）。
圖2：對比細胞濃度和活力
葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量，尤其在500mL搖瓶中，表明底物在第五天之前是足夠的，因此補料可防止底物限制（圖3）.
圖3：對比葡萄糖和谷氨酰胺
已知同時形成銨，乳酸和谷氨酸可降低細胞生長速率。在所有培養(yǎng)物中，在培養(yǎng)的第五天也觀察到亞臨界濃度的銨。此外，通氣和連續(xù)供應(yīng)5％的CO?可以為培養(yǎng)系統(tǒng)提供**緩沖，因此也可以提供合適的pH條件（圖4）。
圖4:比較銨的含量，谷氨酸鹽，乳酸和pH
直接蒸汽加濕對培養(yǎng)基損失有重要影響，同時也會改變滲透壓。
特別是在小工作體積下，一天的最大蒸發(fā)量小于0.4%。
圖5:125mL揮發(fā)量
搖瓶的工作體積對氧交換有很大影響，不應(yīng)超過搖瓶最適工作體積。
7. 總結(jié)
培養(yǎng)2-5天后，細胞總數(shù)達到1.8 x 10?和1.4 x 10?之間。它可用作2.5L生物反應(yīng)器的接種物，活細胞濃度約為每毫升5×10?。
接種細胞密度和細胞活力越高，培養(yǎng)過程中細胞密度越高。
盡早更換培養(yǎng)基
在較小接種量和補料策略允許的情況下，可額外補充細胞培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)。另一方面，培養(yǎng)液被稀釋，因此有毒產(chǎn)物減少。
在85%相對濕度條件下，蒸發(fā)量小于0.5%，可實現(xiàn)穩(wěn)定的滲透壓和工藝再現(xiàn)性。
搖瓶培養(yǎng)可用于進一步的工藝步驟，例如接種生物反應(yīng)器或一次性袋。
13
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)