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SNP分型原理及方法介紹
1、技術(shù)原理
首先通過PCR擴(kuò)增含有SNP的基因[1]組片段，然后通過序列特異性引物實(shí)現(xiàn)單堿基延伸，隨后樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在真空管中受瞬時納秒 (10-9s) 強(qiáng)激光激發(fā)。核酸分子因此解吸附成為單電荷離子，由于電場中離子飛行時間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時間而獲得樣品分析物的分子量，從而檢測出SNP位點(diǎn)信息。
2、主要特點(diǎn)
時間飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF）完成的SNP檢測準(zhǔn)確率可達(dá)99.9%，除了準(zhǔn)確性高、靈活性強(qiáng)、通量大、檢測周期短等優(yōu)勢外，zui有吸引力的應(yīng)該還是它的性價比。飛行時間質(zhì)譜平臺（MALDI-TOF）是通用的基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的研究平臺，該方法憑借其科學(xué)性和準(zhǔn)確性已經(jīng)成為該領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)。
3、主要方法
1. TaqMan探針法
針對染色體上的不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物和TaqMan探針，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增。探針的5’-端和3’-端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)溶液中存在PCR產(chǎn)物時，該探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來，破壞兩熒光分子間的PRET，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。
2. SNaPshot法
該技術(shù)由美國應(yīng)用生物公司（ABI）開發(fā)，是基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱小測序，主要針對中等通量的SNP分型項(xiàng)目。在一個含有測序酶、四種熒光標(biāo)記ddNTP、緊臨多態(tài)位點(diǎn)5’-端的不同長度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸一個堿基即終止，經(jīng)ABI測序儀檢測后，根據(jù)峰的移動位置確定該延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。對于PCR產(chǎn)物模板可通過多重PCR反應(yīng)體系來獲得。通常用于10-30個SNP位點(diǎn)分析。
3. HRM法
高分辨率熔解曲線分析（HRM）是近幾年興起的SNP研究工具，它通過實(shí)時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，來判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、是否是雜合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析。該方法無需設(shè)計(jì)探針，操作簡便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。