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重疊PCR—overlap PCR
1、簡介
重疊PCR也是基本的PCR原理：變性-退火-延伸。不同的是在重疊PCR過程是兩個(gè)或者幾個(gè)片段重疊延伸之后，再進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增的PCR過程。
2、基本原理
*步：PCR產(chǎn)生兩個(gè)或者幾個(gè)片段，這幾個(gè)片段之間必須有重疊區(qū)。
第二步：以兩個(gè)片段為例，見上圖，*步產(chǎn)生的兩個(gè)片段，A D鏈之間有互補(bǔ)，B C鏈之間也有互補(bǔ)，但只有A D鏈互補(bǔ)重疊延伸產(chǎn)生所需要的重疊片段。
第三步：第二步產(chǎn)生的重疊產(chǎn)物，在上下游引物的存在下，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增過程。 請仔細(xì)看清楚原理，特別是第二步。
3.實(shí)際操作注意點(diǎn)
a.*步PCR之后的產(chǎn)物，可以純化，也可以吸取幾μL作為重疊PCR的模板。
b.第二步和第三步一起稱為重疊PCR，實(shí)際發(fā)生過程分為兩個(gè)步驟。
c.Taq酶會在末端加A，高保真酶有3’— 5’的外切活性，基于重疊PCR原理和酶的性質(zhì)，*步和重疊PCR步驟至少有一步使用高保真酶（或者如Taq Plus、EsTaq之類的，有3’— 5’的外切活性），如果*步和重疊PCR都使用普通Taq可能重疊PCR會失敗。
d.基于重疊PCR原理，上圖中第二步A D 鏈直接的退火很關(guān)鍵，所以有些protocol會建議重疊PCR分兩個(gè)程序進(jìn)行也是基于以上原理。重疊區(qū)的Tm很關(guān)鍵，或者說退火溫度很重要。
4.重疊PCR幾個(gè)應(yīng)用場景
.片段中間引入突變
b.片段中間引入缺失
C.片段中間引入插入片段
d.片段拼接(如不同結(jié)構(gòu)域DNA pian段拼接)
e.長片段分段擴(kuò)增，再重疊PCR拼接
f.從基因組擴(kuò)增出外顯子，再拼接出完整的CDS區(qū)