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洗衣粉抗（抑）菌效果鑒定試驗(yàn)
1 原 理
本方法通過模擬洗衣機(jī)的洗衣過程，檢測(cè)除（殺）菌洗衣粉（劑）的抗菌作用。
2 實(shí)驗(yàn)器材
（1）實(shí)驗(yàn)菌株 大腸桿菌（8099或ATCC11229），金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）
（2）培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂A 瓊脂含量為1.5%
營養(yǎng)瓊脂B在營養(yǎng)瓊脂A中另加入1.5 %的瓊脂
營養(yǎng)肉湯
胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）
（3）牛血清白蛋白（過濾除菌）
（4）烷基酚聚氧乙烯醚（Tergitol）
（5）碳酸鈉
（6）標(biāo)準(zhǔn)硬水
（7）非離子浸濕劑
（8）沖洗溶液
（9）含0.5 % 吐溫的磷酸鹽緩沖液
（10）吐溫80（過濾除菌）
（11）無菌去離子水或蒸餾水
（12）不銹鋼轉(zhuǎn)軸由一條直徑0.16cm 不銹鋼絲制成
（13）有金屬螺蓋的玻璃罐容積為470mL，可高壓滅菌，并可放入轉(zhuǎn)軸的廣口罐，將罐口覆蓋牛皮紙，加蓋，于121℃滅菌25min備用
（14）轉(zhuǎn)動(dòng)速度為45r/min～60r/min 的滾動(dòng)搖床
（15）可調(diào)恒溫水浴箱
（16）吸管（1mL、5mL、10mL）
（17）培養(yǎng)皿
（18）鋪有濾紙的玻璃培養(yǎng)皿
（19）菌種保存管
（20）細(xì)菌培養(yǎng)箱
（21）渦流振蕩器
（22）細(xì)菌比濁儀
（23）棉布32織紗/cm × 32 織紗/cm 平織棉布
（24）別針、鑷子、無菌手套、3mm～5mm玻璃珠、秒表、載體布片2.5cm×3.75cm
3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
（1）測(cè)試棉布的制備
1）非離子浸潤(rùn)劑的制備：取 5g烷基酚聚氧乙烯醚，5g 碳酸鈉加入到1L 去離子水中。
2）洗滌液的制備：1.5g 非離子浸潤(rùn)劑，1.5g 碳酸鈉，加入到3L去離子水中。 將大約300g 測(cè)試棉布加入3L 洗滌溶液，加熱煮沸1h，取出棉布在煮沸的去離子水中清洗 5min，然后放入涼去離子水中 5min，以去除殘留的浸潤(rùn)劑，然后將棉布晾干。
（2）測(cè)試棉布和轉(zhuǎn)動(dòng)支架的準(zhǔn)備：取處理過的棉布，剪成5cm 寬，重量為15g 1g的布條，將其一端插入固定在測(cè)試轉(zhuǎn)動(dòng)支架的水平方向的外邊，然后在三條水平支架間以足夠的張力纏繞12個(gè)整圈，將布條的另一端用不銹鋼別針固定在前一圈布條上。zui后以121℃壓力蒸汽滅菌15min，備用。
（3）細(xì)菌懸液的制備：取0.5mL 營養(yǎng)肉湯凍干的菌種溶解，接種于含10mL 的營養(yǎng)肉湯的試管，于35℃2℃培養(yǎng) 24h。 然后振蕩混合均勻。用10μL接種環(huán)在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，置于35℃2℃ 培養(yǎng)24h。然后從平板上挑取單個(gè)菌落種入菌種保藏管中，上下?lián)u動(dòng)10次，吸棄多余液體，置 -85℃冰箱保存。試驗(yàn)前，從菌種保藏管中取出一粒帶菌小顆粒放入營養(yǎng)瓊脂斜面，晃動(dòng)斜面。將斜面至35℃培養(yǎng)24h。每天轉(zhuǎn)種1次，連續(xù)傳三代。
第四天，用5mL PBS洗脫斜面上的菌苔， 取0.5mL 加入到含9.5mL PBS的試管中，混勻，取1mL～2mL加入含有20mL 營養(yǎng)瓊脂B的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使菌液覆蓋整個(gè)瓊脂表面。吸棄多余菌液，然后將培養(yǎng)瓶倒置平放在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
用5mL PBS和3g 滅菌玻璃珠洗脫細(xì)胞瓶中的菌體，用PBS調(diào)整濃度至1×108cfu/mL～5×108cfu/ml，然后加入等量 3.0% 的牛血清白蛋白。
（4）染菌載體的制備：每片載體接種20μL菌懸液，放回培養(yǎng)皿中，加蓋，于35℃2℃ 在培養(yǎng)箱中干燥20min。
（5）測(cè)試樣品的制備：至少在實(shí)驗(yàn)開始前20min， 將盛有265mL硬水的玻璃罐在水浴箱中恒溫至測(cè)試溫度（25℃1℃）。加入被測(cè)試樣品混合溶解。
4 實(shí)驗(yàn)步驟
（1）將2片染菌載體放入轉(zhuǎn)動(dòng)支架的第6和7層布條之間，將第3片放入第7和8層布條之間。
（2）以無菌操作方式將轉(zhuǎn)動(dòng)單元（支架、布條和染菌載體）放入含有測(cè)試產(chǎn)品的玻璃罐中，加蓋。
（3）玻璃罐固定在搖床上，滾動(dòng)旋轉(zhuǎn)洗滌20min，取下玻璃罐。
（4）以無菌操作方式，取出轉(zhuǎn)動(dòng)單元，取出3片染菌載體，放入到含有 30mL 含0.5% 吐溫80的PBS）的試管中，在振蕩器中混合10s。然后振打200次， 用PBS做10倍系列稀釋，并選擇適宜稀釋度樣液接種TSA平板。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。
（5）對(duì)照組除用 0.5% 吐溫80替代測(cè)試產(chǎn)品外，其它實(shí)驗(yàn)條件和步驟均與試驗(yàn)組相同。
（6）菌數(shù)對(duì)照：將3片染菌載體加入含有30mL 0.5% 吐溫80 的PBS試管中，在振蕩器振蕩10s，然后振打80次， 用PBS做系列10倍稀釋，并取適宜稀釋度樣液 1.0mL，以傾注法接種TSA平板，每個(gè)稀釋度接種2兩個(gè)平板。
（7）將試驗(yàn)組、對(duì)照組和菌數(shù)對(duì)照組平板倒置于 35℃?2℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ? 4h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。
（8）以試驗(yàn)同批次的稀釋液、培養(yǎng)基等分別設(shè)陰性對(duì)照。
（9）結(jié)果計(jì)算
試驗(yàn)重復(fù)3次。記錄并計(jì)算測(cè)試樣品的細(xì)菌總數(shù)，求其平均值。 用下列公式計(jì)算除菌率：
抑菌率（%）=（A-B）/A ×100%
其中A為實(shí)驗(yàn)前對(duì)照樣品的菌落數(shù)；B為試驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)樣品的菌落數(shù)。
5 評(píng)價(jià)規(guī)定
各次陰性對(duì)照均無菌生長(zhǎng)，對(duì)照組回收菌數(shù)應(yīng)為1×106cfu/片～5×106
cfu/片，抑菌率達(dá)到50%者，判定為有抗菌作用。
6 注意事項(xiàng)
（1）將旋轉(zhuǎn)單元放入玻璃罐后應(yīng)將蓋子蓋緊，以防轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)漏水。
（2）試驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，以防止雜菌污染。