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藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證淺談
相對(duì)于未知的藥物靶點(diǎn)來(lái)說(shuō)，已知的藥物靶點(diǎn)只不過(guò)是冰山一角。如何能在眾多的未知里發(fā)現(xiàn)并找到有效的藥物靶點(diǎn)？靶點(diǎn)的選擇在整個(gè)藥物研發(fā)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。現(xiàn)代藥物研究中，新靶點(diǎn)的建立往往是新藥創(chuàng)新的前提和保障。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的完成，出現(xiàn)了大量可供治療干預(yù)的新型分子靶點(diǎn)，但并不是所有的靶點(diǎn)都能夠成為與疾病有關(guān)的有效靶點(diǎn)，因此對(duì)新型靶點(diǎn)進(jìn)行開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證便成為非常重要的工作。
據(jù)統(tǒng)計(jì)，除抗感染、抗病毒和抗寄生蟲(chóng)類藥物以外，制藥工業(yè)用來(lái)作為藥物靶向篩選的靶標(biāo)已有417種，包括受體、酶、離子通道等，藥物靶標(biāo)大體涉及10個(gè)系統(tǒng)的功能和疾患：外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌、炎癥反應(yīng)、血液及造血、癌瘤、心腎系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、維生素缺乏、泌尿系統(tǒng)。到目前為止，已經(jīng)有數(shù)千個(gè)靶點(diǎn)類蛋白被克隆純化，包括大約包括大約750個(gè)G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、100多個(gè)配體門(mén)控性離子通道、60多個(gè)核受體、50多個(gè)細(xì)胞因子和大約20個(gè)具有重吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白質(zhì)。多種靶點(diǎn)識(shí)別方法得到的藥物作用靶點(diǎn)只能作為靶點(diǎn)初步篩選的方法，之后需要對(duì)候選靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。藥物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證需要許多生物技術(shù)作支撐：
基因水平的技術(shù)
高通量基因表達(dá)技術(shù)
cDNA過(guò)表達(dá)技術(shù)
基因敲除(Konck-out)技術(shù)
蛋白質(zhì)水平技術(shù)
酵母雙雜交系統(tǒng)
蛋白質(zhì)組學(xué)
基因水平技術(shù)靶點(diǎn)驗(yàn)證示例：步就是確認(rèn)此靶點(diǎn)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中是否調(diào)節(jié)化合物的生物活性。可以通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默某一疾病的基因，形成缺乏特定靶標(biāo)的小鼠，將藥物注射到基因敲除的小鼠中，若藥物沒(méi)有引起效應(yīng)，說(shuō)明藥物是通過(guò)這一特定靶點(diǎn)作用的。除了RNA干擾技術(shù)，也可以用cDNA過(guò)表達(dá)來(lái)建立藥物-靶點(diǎn)作用關(guān)系，靶點(diǎn)的過(guò)表達(dá)可能會(huì)抑制藥物的活性。這種方法對(duì)于驗(yàn)證膜靶點(diǎn)極為重要，一旦假定的靶點(diǎn)通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，就需要對(duì)小分子物質(zhì)及靶點(diǎn)的親和力進(jìn)行量化。如果假定的靶點(diǎn)是一種酶，則要通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)此物質(zhì)的酶活力。后還需要通過(guò)NMR等進(jìn)行更嚴(yán)格的驗(yàn)證，進(jìn)而得到藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。這些信息不僅可以驗(yàn)證物理上的關(guān)聯(lián)性，也可以提供后期藥物優(yōu)化中結(jié)合模型的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。
盛世華康核心業(yè)務(wù)之一，就是致力于利用先進(jìn)的技術(shù)方法幫助藥物研發(fā)企業(yè)識(shí)別和驗(yàn)證已知或全新的藥物靶點(diǎn)。使客戶能夠?qū)δ硞€(gè)項(xiàng)目盡快做出評(píng)價(jià)和決策，從而有效的降低客戶在藥物研發(fā)項(xiàng)目上投入的資金和人力風(fēng)險(xiǎn)。涵蓋靶點(diǎn)篩選，新靶點(diǎn)細(xì)胞系的選擇，靶點(diǎn)的驗(yàn)證及功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。
新靶點(diǎn)細(xì)胞系的選擇
通過(guò)qPCR和WB分別從mRNA水平和蛋白水平來(lái)考察不同待選細(xì)胞之間的差異。根據(jù)客戶的需要找到合適的細(xì)胞系開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
藥物靶點(diǎn)篩選
建立了藥物靶點(diǎn)篩選平臺(tái)，通過(guò)shRNA或sgRNA文庫(kù)的篩選，幫助客戶找到與潛在的多樣的藥物新靶點(diǎn)。并通過(guò)下游的靶點(diǎn)驗(yàn)證進(jìn)一步明確靶點(diǎn)的功能。
藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證
1.siRNA或者siRNA復(fù)合物介導(dǎo)靶基因的沉默
通過(guò)qPCR或WB技術(shù)分別驗(yàn)證mRNA或蛋白水平的基因沉默；
通過(guò)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)或軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)靶基因沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞2D和3D生長(zhǎng)水平的抑制作用；
2.shRNA介導(dǎo)的基因沉默
通過(guò)qPCR或WB技術(shù)分別驗(yàn)證shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株靶基因沉默效果；
細(xì)胞凋亡檢測(cè)；
研究信號(hào)通路和生物標(biāo)志物檢測(cè)；
通過(guò)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)或軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)靶基因沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞2D和3D生長(zhǎng)水平的抑制作用；