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液相色譜之反相液相色譜
反相色譜（reversed phasc chromatography, RPC）是基于溶質(zhì)、極性流動(dòng)相和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式，任何一種有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高，在液相色譜中這是應(yīng)用面廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動(dòng)相多采用酸性的、低離子強(qiáng)度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機(jī)改性劑，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外，也有少量高聚物微球。實(shí)驗(yàn)表明，烷基鏈長(zhǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的反相保留沒(méi)有顯著的影響，但在蛋白質(zhì)的活性回收上短鏈烴基（如C4，C8，苯基）和長(zhǎng)鏈烷基（如C18，C22）反相填料是有區(qū)別的。表現(xiàn)在烷基鏈越長(zhǎng)，固定相的疏水性越強(qiáng)，因而為使蛋白質(zhì)較快洗脫下來(lái)，需要增加流動(dòng)相的有機(jī)成分。過(guò)強(qiáng)的疏水性和過(guò)多的有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不可逆吸附和生物活性的損失?？偲饋?lái)說(shuō)，在烷基鍵合硅膠上的反相色譜，由于其柱效高、分離度好、保留機(jī)制清楚，是蛋白質(zhì)的分離、分析、純化和結(jié)構(gòu)闡明廣泛使用的一種方法。
由于在反相色譜中，使用了乙腈、甲醇等價(jià)格高且有一定毒性的試劑，在一定程度上使該方法的使用受到限制。例如可使部分蛋白失活。因此，該方法用在分析鑒定方面更多一些，特別是對(duì)有機(jī)溶劑具有耐受性的樣品。例如多肽樣品，可用HPRPC對(duì)合成的肽huBPP進(jìn)行分析。
（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
用HPRPC對(duì)huBPP進(jìn)行純度鑒定。
（二）材料和試劑
1，儀器：液相色譜儀，Beckman公司gold system.
2，色譜柱：⑴ 名稱(chēng)：Diamonsil TM（鉆石） C18柱，5цm
⑵ 規(guī)格：250×4.6mm
3，試劑：甲醇（HPLC級(jí)）、三氟己酸（TFA）、乙腈 （HPLC級(jí)）、雙蒸水
（三）樣品準(zhǔn)備
取待分析的huBPP，稱(chēng)量，用0.1%的TFA液溶解，配制成濃度大于1mg/ml的液體。必要時(shí)過(guò)濾或離心。
（四）操作
1、液體準(zhǔn)備：A液0.1%TFA，B液液，99.9%乙腈，0.1%TFA，脫氣。
2、開(kāi)機(jī)
3、上柱
4、輸入?yún)?shù)
檢測(cè)波長(zhǎng) 245nm
流速 1ml/min
流動(dòng)相： A液：0.1%TFA
B液：99.9%乙腈-0.1%TFA
洗脫條件：0-100% B 20min
5、平衡色譜柱 一般反相柱都保存在甲醇中，應(yīng)置換出甲醇，用A液平衡色譜柱，待基線(xiàn)平穩(wěn)后準(zhǔn)備上樣。必要時(shí)，可按洗脫條件不上樣運(yùn)行一遍程序，以洗出色譜柱可能存在的雜質(zhì)。
6、上樣，取20цl樣，注入上樣閥，將閥門(mén)扳下，即上樣。
7、進(jìn)行分離，鑒定。
8、打印結(jié)果，并分析，可得到峰數(shù)，峰高，面積百分比，保留時(shí)間等參數(shù)。
9、用B液洗柱5min，若不再使用時(shí)，換成甲醇，洗滌后保存。
附：色譜柱操作說(shuō)明，（以迪馬公司Diamonsil(TM)柱為例）
1. 色譜柱常規(guī)參數(shù)
訂貨號(hào)：Catalog.No. 產(chǎn)品號(hào) Serial No.
出廠(chǎng)日期 Date
填料 Column Paking 如，Diamonsil(TM)鉆石C18 5цm
柱規(guī)格 Column Dimension 250×4.6mm
填料批號(hào) Material Lot No. 0206
保證柱效 Guarantee Plate Number N>70,000/m(usp 1/2 Peak height)
不對(duì)稱(chēng)因子 Asmmetry Factor As=0.8-1.4(5% Peak height)
測(cè)試報(bào)告 （附色譜圖） 略
2. 驗(yàn)收色譜柱
⑴ 檢查色譜柱外觀(guān)是否完好。
⑵按柱參數(shù)逐項(xiàng)檢查是否與您的需求相符，如規(guī)格等。
3. 流動(dòng)相使用
⑴檢查色譜柱允許使用流動(dòng)相及pH，如，凝膠柱常規(guī)用緩沖液，反相柱用有機(jī)溶劑，鉆石C18柱允許pH為2-7.5。
⑵ 注意流動(dòng)相的粘度對(duì)柱后的影響，如甲醇/水系統(tǒng)高于乙腈/水系統(tǒng)。
⑶ 流動(dòng)相、樣品使用時(shí)過(guò)濾，常用0.45μm膜，分清水溶性和脂溶性膜。一般在色譜柱口有0.2μm的膜保護(hù)，以免堵塞色譜柱。
⑷ 流動(dòng)相應(yīng)脫氣。
4. 色譜柱安裝
⑴ 確證柱與儀器的接頭，管路匹配。
⑵ 安裝柱之前，檢查流路系統(tǒng)中的溶劑是否正常。
⑶ 為減少死體積使進(jìn)樣閥與色譜柱和檢測(cè)器之間的連接管路內(nèi)徑盡量細(xì)，如0.01英寸。
5. 對(duì)樣品要求
⑴ 樣品應(yīng)與流動(dòng)相互溶。
⑵ 樣品濃度要在一定范圍內(nèi)，不同色譜柱要求不同。
⑶ 樣品中不能有不溶物，用前應(yīng)用針頭或過(guò)濾器過(guò)濾。
⑷ 樣品不應(yīng)與流動(dòng)相發(fā)生反應(yīng)。
6. 色譜柱的使用
⑴ 色譜柱后封裝的溶劑一般與檢測(cè)報(bào)告相同或特別注明，若更換流動(dòng)相時(shí)，流速要慢，一般不超過(guò)0.5ml/mim。
⑵ 請(qǐng)勿頻繁改變流動(dòng)相，否則，會(huì)加速降低柱效。
⑶ 注意不同色譜柱耐壓程度不同，壓力要在柱耐壓范圍內(nèi)，為獲得*分離效果，鉆石C18柱使用勿超過(guò)200bar(300psi)。
⑷ 若使用保溫柱時(shí)，注意溫度影響。
7. 色譜柱的保存
⑴ 若流動(dòng)相中使用鹽或酸試劑，保存前應(yīng)先用水沖洗干凈（約20倍柱體積）。
⑵ 泵入保存液，不同色譜柱用不同保存液，鉆石C18柱應(yīng)盡可能用100%乙腈或甲醇保存。
⑶ 卸下色譜柱后，立即用接頭密封，放在穩(wěn)定環(huán)境中保存。
8. 柱的再生
不同柱用不同方法再生，請(qǐng)參看各種色譜柱說(shuō)明。
鉆石反相鍵合相C18、C8、pH、CN柱用以下程序：
用20倍柱體積的溶劑按下列程序沖洗色譜柱。（按箭頭方向沖）
水→甲醇→氯f(wàn)ang→甲醇
水沖洗時(shí)可用熱蒸溜水（55℃）或加入少量（0.8%）DMSO沖洗。
一般情況下不提倡反向沖洗色譜柱，必要時(shí)可反向沖。
