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近日，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點實驗室朱煥章課題組設(shè)計并構(gòu)建出只在HIV感染細胞上才能切除HIV-1前病毒的誘導(dǎo)型鋅指蛋白核酸酶（ZFN-Tat），避免了ZFN持續(xù)表達可能引起的潛在脫靶效應(yīng)，為該技術(shù)在臨床上安全、有效地應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。相關(guān)研究結(jié)果近日發(fā)表在期刊《Molecular Therapy- Nucleic Acids》；

抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療能顯著改善艾滋病患者的生存率，但該療法并不能治愈病人，其原因是抗病毒yao物僅能抑制復(fù)制，并不能對感染細胞基因組中HIV前病毒起作用，即“治標不治本”。因此，如何靶向清除整合在免疫細胞基因組上的HIV前病毒，是目前艾滋病治療研究領(lǐng)域zui富有挑戰(zhàn)性的科學(xué)問題；倘若能使整合的HIV前病毒從靶細胞基因組上缺失，那么，則可從根本上解決艾滋病不能治愈的問題，實現(xiàn)“斬草除根”的夢想。

目前，基于基因編輯技術(shù)的基因治療大約有20 多個方案進入臨床試驗，效果令人鼓舞，但其安全性問題仍需要考慮，譬如脫靶效應(yīng)和免疫原性。2017 年 5 月 30 日，《自然•方法》（Nature Methods）報道了來自哥倫比亞大學(xué)等機構(gòu)的研究人員發(fā)現(xiàn)，在治愈小鼠相關(guān)疾病遺傳性疾病的同時，基因編輯常用的工具 CRISPR/Cas9 可能會造成很多意料之外的基因突變。盡管，該文已撤稿，但技術(shù)本身的潛在脫靶效應(yīng)是存在的。2018年1月，《自然》（Nature）報道了斯坦福大學(xué)Weinberg博士團隊的一項新研究，發(fā)現(xiàn)七成的健康人體內(nèi)存在Cas9蛋白同源物抗體，近半數(shù)人具有Cas9蛋白同源物的抗原特異性T細胞。人體會對Cas9酶產(chǎn)生免疫反應(yīng)，意味著人體自身的免疫系統(tǒng)可能會破壞基于CRISPR-Cas9開發(fā)的基因療法。Weinberg博士對此表示，Cas9只在短時間內(nèi)開啟或表達，或者可以將Cas9進行重新設(shè)計使其不會引起免疫反應(yīng)或抑制免疫系統(tǒng)本身。因此，開發(fā)有效性與安全性于一體的基因編輯技術(shù)是臨床應(yīng)用的前提。

2013年，朱煥章教授課題組在上使用ZFN，成功切除了整合在基因組中的HIV-1前病毒。相關(guān)研究工作發(fā)表在了《Nucleic Acids Res》上，被《Nature Biotechnology》等雜志引用達到102次，是復(fù)旦大學(xué)2016年高被引文章之一。2017年，該技術(shù)已獲得國內(nèi)shou個基因編輯技術(shù)在疾病上應(yīng)用的授權(quán)。朱煥章教授課題組在此基礎(chǔ)上，利用反式激活因子Tat可與HIV-1調(diào)控區(qū)LTR上反式激活應(yīng)答元件TAR結(jié)合以促進病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的原理，設(shè)計并構(gòu)建了以HIV-1調(diào)控區(qū)LTR為啟動子，通過反式激活因子Tat來調(diào)控ZFN的表達載體。由于Tat蛋白是HIV*的病毒蛋白，僅在HIV-1病毒感染的細胞表達，而Tat蛋白可與調(diào)控載體ZFN 上游調(diào)控區(qū) TAR元件結(jié)合，可誘導(dǎo)ZFN表達，從而導(dǎo)致ZFN介導(dǎo)前病毒基因切除 。伴隨HIV-1前病毒的切除，Tat蛋白表達量將會減少，由此誘導(dǎo)的ZFN表達又恢復(fù)到背景水平，因而，可避免ZFN持續(xù)表達可能引起的潛在脫靶效應(yīng)或免疫反應(yīng)。將依賴Tat的ZFN表達載體轉(zhuǎn)染HIV病毒感染細胞，結(jié)果顯示大約30%感染細胞中HIV前病毒被切除（圖1B）。若轉(zhuǎn)染效率為100%的話，HIV前病毒被切除效率可達60%以上。

圖 ZFN在HIV-1感染的細胞中依賴Tat誘導(dǎo)全長前病毒切除。左圖為示意圖，右圖為ZFN表達載體轉(zhuǎn)染HIV病毒感染細胞后流式細胞儀檢測切除效率。

近幾年來，朱煥章課題組在艾滋病基因治療新型策略研究方面取得了階段性進展。利用基因編輯三大技術(shù)，除了前述靶向切除HIV前病毒外，也獲得了靶向抑制HIV或干預(yù)HIV潛伏的ZFP、TALE以及dCas9系統(tǒng)，證實了這些系統(tǒng)的有效性（Molecular Therapy, 2016, 508-521. Molecular Therapy- Nucleic Acids, 2017, 233-242）.Gene Therapy ，2014，90-95；AIDS Res Hum Retroviruses，2015，98-106）。