神經(jīng)元培養(yǎng)的portocol，是較難培養(yǎng)的一種細(xì)胞。關(guān)鍵就是大鼠年齡的選擇，是胎鼠，新生鼠還是成年大鼠，理想的是胎鼠。今天喆圖小編就從這個(gè)說(shuō)起，用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞的幾種培養(yǎng)的方法。
1.海馬分離：剖宮產(chǎn)取出胚胎，放在保存液中移至顯微鏡下操作取出胎腦，去掉小腦，從中線(xiàn)切開(kāi)左右大腦半球。剝?nèi)ボ浤X膜以及脈絡(luò)叢血管。然后鈍性分離海馬，顯微鏡下用剪刀剪下海馬即可
2. 組織消化和計(jì)數(shù)：每個(gè)取出的海馬組織都放置在含有4℃培養(yǎng)液的試管中。快速分離數(shù)個(gè)胎鼠海馬后就可以做消化和細(xì)胞計(jì)數(shù)了。消化液用經(jīng)典的胰蛋白酶于恒溫培養(yǎng)箱中 37℃恒溫 30分鐘即可。然后吹打(1000ul tip 10-20次，2ml 灼燒拉伸的玻璃管，口徑與200ul tip相當(dāng)，吹打10-20次)到看不到組織為止。很多protocol建議此刻離心。消化后去上清，留1-2ml直接吹打，然后就可以直接細(xì)胞計(jì)數(shù)。
3. 分盤(pán)培養(yǎng)：神經(jīng)元會(huì)長(zhǎng)的很大，所以密度要低，50000/ml就可以了，100mm的plate, 5-7ml。培養(yǎng)液用無(wú)血清無(wú)抗生素加B27和N2的DMEM效果就很好。培養(yǎng)皿要用PDL和含血清以及抗生素的培養(yǎng)液預(yù)處理72小時(shí)。這樣可以避免感染也讓神經(jīng)元容易附著和分化。每一周加1-2ml的新鮮培養(yǎng)液，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫，2-3周即可成熟。
4.染色檢測(cè)：后就是標(biāo)記蛋白檢測(cè)，一般可用MAP2標(biāo)記神經(jīng)纖維，一些神經(jīng)遞質(zhì)受體標(biāo)記突觸，NeuN標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞核。
以上恒溫培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)內(nèi)容僅供參考，詳情請(qǐng)聯(lián)系喆圖客服！
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