NAD 激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

測(cè)定意義：

NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)惟一能夠催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，可催化 NAD(H)以 ATP 或無(wú)機(jī)多聚磷酸

[poly(P)]作為磷?；w進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，生成 NADP(H)。因此，NAD 激酶在合成 NADP(H)

以及調(diào)節(jié) NAD(H)與 NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測(cè)定原理：

NADK 催化 NAD⁺磷酸化，生成 NADP⁺；NADP⁺可被 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為 NADPH； NADPH 通過(guò) PMS 的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT），通過(guò)在 600 nm 下測(cè)定 MTT 的還原速度（吸光值的變化）可反映出 NADK 活性的大小。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 20 mL×1 瓶，4℃保存；試劑二：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存；試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；試劑五：粉劑×1 瓶, -20℃保存；

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一和試劑二 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 15min 以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入 16mL 試劑一，充分混勻待用。工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入 22mL 試劑二，充分混勻待用。工作液Ⅲ的配制：在試劑五中加入 22mL 試劑二，充分混勻待用。

4、加樣表

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 15min，立即煮沸2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻，10000g，室溫離心 10min，取上清

加完試劑混勻后立即在 600nm 下測(cè)定 30 秒的吸光值 A1 和 3 分鐘 30 秒時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算△A= A2-A1

NADK 活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（U/mg prot）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷（V1×Cpr）÷T=135.3×（△A - 0.004）÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（U/g 鮮重）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷(W×V1÷V2）÷T =135.3×（△A - 0.004）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（U/10⁴ cell）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷（500×V1÷V2）÷T =0.271×（△A - 0.004）V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g;；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。