主要用途

細(xì)胞蛋白磷酸化酶2A（PP2A）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用特異性合成底物磷酸化多肽，在PP2A去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后峰值的變化，采用比色法測(cè)定其峰值的變化，以此進(jìn)行測(cè)算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞裂解懸液樣品包括免疫沉淀復(fù)合物和粗提或部分純化酶樣品的蛋白磷酸化酶2A活性及其抑制劑的檢測(cè)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent E）、顯色液（Reagent F）和專性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸； 有效保證6月

 用戶自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品收集

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

500微升1厘米光徑比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入3毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞 

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取2微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)為660nm，并置零  

3． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

4． 按下表分別加入陰性液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到每個(gè)離心管，混勻

5． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1． 移取200微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿

2． 在30℃溫度下孵育20分鐘

3． 加入200微升顯色液（Reagent F），混勻

4． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

5． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

6． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次

7． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

四、 （選擇步驟）樣品背景測(cè)定

1． 移取120微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白） 

3． 在30℃溫度下孵育20分鐘

4． 加入60微升陰性液（Reagent D），混勻

5． 加入200微升顯色液（Reagent F），混勻

6． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

8． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升

五、 樣品總活性測(cè)定

1． 移取100微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白） 

3． 在30℃溫度下孵育2分鐘

4． 加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 在30℃溫度下孵育20分鐘

6． 加入60微升陰性液（Reagent D），混勻

7． 加入200微升顯色液（Reagent F），混勻

8． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

10． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

六、 樣品非特異性活性測(cè)定

1． 移取90微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升專性液（Reagent H）

3． 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白） 

4． 在30℃溫度下孵育5分鐘

5． 加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

6． 在30℃溫度下孵育20分鐘

7． 加入60微升陰性液（Reagent D），混勻

8． 加入200微升顯色液（Reagent F），混勻

9． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

10． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

11． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品非特異活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）