免疫技術(shù)用熒光染料

    在流式細(xì)胞計的應(yīng)用中，熒光色素是關(guān)鍵試劑，免疫熒光的檢測，對試劑的要求尤其具有特殊性。

     對熒光染料的要求1、染料必須在理想的激光光源的某一波長有強(qiáng)烈吸收；2、由于免疫熒光測定，信號的強(qiáng)度是主要限制因素，故要求染料應(yīng)有較高的量子效應(yīng)3、激發(fā)光和發(fā)射光之間要有較大的波長區(qū)別，以便使熒光能與激發(fā)光源所造成的背景區(qū)別開來4、便于同抗體和其他蛋白偶聯(lián)，又不影響其熒光及抗體的特異性。

熒光染料  常見者見表。其中FITC已為國內(nèi)免疫界通用，此外不做介紹。當(dāng)前國內(nèi)常用的商品化的染料類是藻膽蛋白（Ohycobili protein）是來自光合青色細(xì)菌（photosyntheric  cyanobacteria）和紅色藻類（Red algae）的自然熒光色素。其基本類型為：藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）、藻青蛋白（Phycocyanin）及別藻青蛋白（Allophycocyanin，APC),其分子結(jié)構(gòu)基本是幾個帶有開鏈四吡咯色基因的多肽混合物，很適合標(biāo)記抗體，它們有以下特點：可以在廣泛的波長下有效地激發(fā)；每個分子都帶有許多產(chǎn)生高激發(fā)系數(shù)的發(fā)光色基團(tuán)；激發(fā)光、發(fā)射光易鑒別（Stokes位移大）；易溶于水，發(fā)出的熒光不受pH影響，因而不易受生物因素影響而淬滅。這類熒光色素的代表是藻紅蛋白。目前，盡管應(yīng)用者較多，但其標(biāo)記困難及結(jié)合物易形成素脫落，保存時間短等缺點，也影響其推廣，人們正在尋找新的熒光染料。為了測定細(xì)胞表面的多種標(biāo)記，還應(yīng)考慮免疫熒光染料反光源和這些顏料的相互配合的要求；1、兩種以上抗體同兩種以上色素交聯(lián)，該色素可被單波長光激發(fā)，并能通過特殊的發(fā)射光區(qū)別開；或用不同激發(fā)波長來激發(fā)，發(fā)射光可通過光譜的差異、特殊發(fā)射光或發(fā)射時間不同來區(qū)別。2、結(jié)合抗體的色素不干擾抗體反應(yīng)的特異性，或同一實驗中其他色素的特性。3、適用一步、二步、三步染色法，加適當(dāng)對照組能克服試劑間的干擾。

    為了測定細(xì)胞表面的多種標(biāo)記，還應(yīng)考慮免疫熒光染料反光源和這些顏料的相互配合的要求；1、兩種以上抗體同兩種以上色素交聯(lián)，該色素可被單波長光激發(fā)，并能通過特殊的發(fā)射光區(qū)別開；或用不同激發(fā)波長來激發(fā)，發(fā)射光可通過光譜的差異、特殊發(fā)射光或發(fā)射時間不同來區(qū)別。2、結(jié)合抗體的色素不干擾抗體反應(yīng)的特異性，或同一實驗中其他色素的特性。3、適用一步、二步、三步染色法，加適當(dāng)對照組能克服試劑間的干擾。