由于高度選擇性的血腦屏障，人腦微血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組織能夠?qū)崿F(xiàn)功能特異性，并確保對(duì)人類神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)。腦微環(huán)境調(diào)節(jié)構(gòu)成腦微血管的主要細(xì)胞類型的表型：腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞。
血液流經(jīng)微血管系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的持續(xù)剪切應(yīng)力尤其影響細(xì)胞的形態(tài)和功能。有報(bào)道稱它可以上調(diào)一些連接蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、離子通道并限制腦微血管內(nèi)皮的通透性。然而，其他研究表明，沒有或只有部分關(guān)鍵血腦屏障標(biāo)志物顯著過度表達(dá)（例如 Claudin 5、Zonula occludens-1、Occludin、CD31、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1 或 P-糖蛋白），盡管來自介質(zhì)的機(jī)械應(yīng)力確實(shí)促進(jìn)了大腦微血管系統(tǒng)*的內(nèi)皮細(xì)胞的分化或成熟。
培養(yǎng)和流動(dòng)參數(shù)（例如施加的壓力和處理時(shí)間）的差異可以部分解釋這些不一致，特別是因?yàn)檫^高或擾動(dòng)的剪切應(yīng)力可能會(huì)逆轉(zhuǎn)其有益影響。生化信號(hào)也容易受到模型中使用的細(xì)胞類型的影響。已證明使用星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基與剪切應(yīng)力對(duì)上調(diào) Zonula occludens-1 和降低腦內(nèi)皮細(xì)胞通透性具有同等重要的作用。很少有研究將星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞或兩者引入到流動(dòng)培養(yǎng)的腦微血管模型中，盡管與靜態(tài)條件相比，它們似乎觀察到更大的差異。也很少有研究考慮到細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的重要性及其與細(xì)胞培養(yǎng)流動(dòng)的綜合影響。基于膠原蛋白或纖維蛋白的凝膠中的細(xì)胞自組織是一種先進(jìn)的技術(shù)，可用于開發(fā)類似網(wǎng)絡(luò)的大腦微血管系統(tǒng)。日本大阪大學(xué)工學(xué)研究生院應(yīng)用化學(xué)系、東京藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院、日本國(guó)立先進(jìn)工業(yè)科技研究所的研究團(tuán)隊(duì)之前開發(fā)了這種在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的大腦微血管系統(tǒng)的自組織三維（3D）體外模型。基于此，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，著重探討了機(jī)械刺激在 7 天的培養(yǎng)過程中，通過 ECM 的介質(zhì)流動(dòng)，對(duì)放大的人腦血管模型的形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)的影響。
腦血管 3D 體外模型的 ECM 由 I 型膠原微纖維（CMF）和纖維蛋白組成。頂部：在靜態(tài)條件下培養(yǎng)；底部：在流動(dòng)條件下培養(yǎng)
使用優(yōu)化的接種參數(shù)，培養(yǎng) 7 天后，無論是在靜態(tài)條件下還是在壓力驅(qū)動(dòng)的微生理系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)（測(cè)量流速為 379 ± 37 μL min-1），細(xì)胞均自組織形成毛細(xì)管狀網(wǎng)絡(luò)。這在 HBEC 的 CD31 免疫染色中尤為明顯（圖 2）。與預(yù)期不同的是，微血管主要在凝膠中水平生長(zhǎng)，垂直于流動(dòng)方向。因此，不認(rèn)為微血管是通過管腔灌注的，而更有可能是間質(zhì)剪切流從基底側(cè)影響細(xì)胞。這種機(jī)械應(yīng)力影響了血管的形成和成熟。流動(dòng)培養(yǎng)似乎確實(shí)誘導(dǎo)了一個(gè)更明確的網(wǎng)絡(luò)。流動(dòng)培養(yǎng)的細(xì)胞自組織成更多的管狀形狀，厚度更小，連接更少，并且在水凝膠中略深。因此，間質(zhì)流動(dòng)可用于調(diào)節(jié)和空間引導(dǎo)血管生成。
圖2 人腦內(nèi)皮細(xì)胞的共聚焦圖像（紅色，CD31 免疫染色）在靜態(tài)或流動(dòng)培養(yǎng) 7 天后形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。(A) x20 放大倍率的 z-stack 投影，
(B) RapiClear 處理后的樣本，側(cè)面的 xz 和 yz 投影，
(D) 星形膠質(zhì)細(xì)胞的 x60 倍的截面（綠色，用 CellTracker Green 染色）和周細(xì)胞（藍(lán)色，用 CellTracker Red 染色）。
靜態(tài)和流動(dòng)條件均誘導(dǎo)毛細(xì)血管樣小管顯示管腔，如組織學(xué)切片所示。有趣的是，在比較靜態(tài)和流動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)管腔尺寸發(fā)生顯著變化。然而，在流動(dòng)下培養(yǎng)的微血管系統(tǒng)比在靜態(tài)條件下培養(yǎng)時(shí)有更高的管腔數(shù)的趨勢(shì)。
通過 RT-qPCR 分析了對(duì)血腦屏障功能至關(guān)重要的緊密連接蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和載體的基因表達(dá)。與靜態(tài)條件相比，流動(dòng)培養(yǎng)似乎促進(jìn)了這種基因表達(dá)。所有評(píng)估的基因：Claudin 5 (Cld5)、Zonula occludens-1 (ZO-1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (Glut1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (TfR)、乳腺癌耐藥蛋白 (BCRP) 和 P-糖蛋白 (PgP)，與靜態(tài)條件下培養(yǎng)的樣品相比，在流動(dòng)下進(jìn)行培養(yǎng)的樣品傾向于過度表達(dá)。Glut1、TfR 和 BCRP 的增加是顯著的，但其他基因無明顯升高。
總體而言，這項(xiàng)研究表明，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)7天可導(dǎo)致微血管網(wǎng)絡(luò)中內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞的自組織，其清晰度更高。雖然管腔尺寸沒有改變，但觀察到管腔數(shù)量略有增加。同樣，緊密連接蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和載體的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)似乎也會(huì)因間質(zhì)流動(dòng)而增強(qiáng)。該模型顯示了血流對(duì)體外三維腦微血管模型調(diào)節(jié)的重要影響。使用來自連續(xù)流動(dòng)的機(jī)械應(yīng)力來引導(dǎo)微血管定向是可以預(yù)見的下一步研究方向。接下來的研究目標(biāo)是使微血管在長(zhǎng)期流動(dòng)培養(yǎng)和可灌注下保持穩(wěn)定，從而更接近于體內(nèi)條件。參考文獻(xiàn)：Figarol A, Piantino M, Furihata T, Satoh T, Sugiura S, Kanamori T, Matsusaki M. Interstitial flow regulates in vitro three-dimensional self-organized brain micro-vessels. Biochem Biophys Res Commun. 2020 Dec 10;533(3):600-606. doi: 10.1016/j.bbrc.2020.09.061. Epub 2020 Sep 26. PMID: 32988592.小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。
會(huì)員.png)
8
