動脈粥樣硬化病變的非隨機(jī)分布與不同的血流模式和作用于血管壁的血流動力學(xué)有關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷暴露于不同的流動模式和剪切應(yīng)力，包括低剪切應(yīng)力和振蕩剪切應(yīng)力（OSS）的擾動流和相對高剪切應(yīng)力的脈動流（PSS），導(dǎo)致對血管壁產(chǎn)生不同的影響。PSS 通常具有抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用，而 OSS 的擾動流會促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成和進(jìn)展。

之前的研究表明，ECs 能夠?qū)?OSS 感知為一種機(jī)械信號，以誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（BMPR）相關(guān)的 Smad1/5 的力特異性激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白A 的上調(diào)和 p21 和 p27 的下調(diào)，從而增加 EC 細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖。因此，Smads 的力特異性激活可能是一種有前途的基于血流動力學(xué)的分子靶點，可用于干預(yù)與血流紊亂相關(guān)的血管疾病，如動脈粥樣硬化。

據(jù)報道，石榴提取物（PE）通過降低循環(huán)中的低密度脂蛋白水平和巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞的形成來發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。長期補(bǔ)充 PE 通過上調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)和調(diào)節(jié) ECs 中氧化敏感基因的表達(dá)來抑制 OSS 相關(guān)的動脈粥樣硬化。然而，石榴皮多酚（PPP）的提取物及其純化的化合物安石榴甙（punicalagin，PU）是否對OSS誘導(dǎo)的血管功能障礙具有改善作用，從而防止動脈粥樣硬化尚不清楚。

在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系、新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院、國家衛(wèi)生研究院（中國臺灣）、香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院的一項聯(lián)合研究中，證明了 PU 是 PPP 的生物活性抗動脈粥樣硬化成分，并進(jìn)一步研究了 PPP 和 PU在體外和體內(nèi)OSS 誘導(dǎo)的 EC 功能障礙和炎癥相關(guān) VSMC 病理生理反應(yīng)中的作用。該研究提供了新的信息，表明 PPP 和 PU 作為治療動脈粥樣硬化的新治療成分可能具有很大的潛力。

首先，En face免疫染色顯示，用 750 mg/kg的PPP 處理可使小鼠主動脈中油紅 O-染色斑塊的面積減少 56%，而 250 mg/kg 和 500 mg/kg 的 PPP 使斑塊面積減少 23% 和 37%。這些數(shù)據(jù)表明，PPP在體內(nèi)以劑量依賴性方式發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

主動脈根部病變面積是主動脈瓣狹窄的重要參數(shù)，與動脈粥樣硬化斑塊的嚴(yán)重程度相關(guān)。因此，在主動脈根部的橫截面中進(jìn)一步測量了斑塊面積。結(jié)果表明，在 PPP 處理的低密度脂蛋白受體敲除（LDLR^–/– ）小鼠的病變區(qū)域中，Mac-2 染色的巨噬細(xì)胞含量顯著減少，表明 PPP 減輕了斑塊中炎性巨噬細(xì)胞的浸潤。

脂質(zhì)代謝紊亂被認(rèn)為在動脈粥樣硬化的進(jìn)展中起重要作用。用 750 mg/kg 或 500 mg/kg PPP處理 LDLR^–/– 小鼠顯著降低了血漿甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）的水平。

由于 PU 是 PPP 中的主要生物活性化合物，因此研究了 PU 處理是否對動脈粥樣硬化產(chǎn)生與 PPP 相似的保護(hù)作用。結(jié)果表明，PU的效果與 PPP 類似。此外，PU 處理還降低了 HFD 喂養(yǎng)的 LDLR^–/– 小鼠的血漿 TC 和 TG 濃度而不影響體重。這些結(jié)果表明，PU 是 PPP 中主要的活性抗動脈粥樣硬化成分。

PPP 和 PU 發(fā)揮內(nèi)皮依賴性血管保護(hù)作用

然后實驗研究了 PPP 和 PU 是否可以通過改善血管功能發(fā)揮超出上述作用的動脈粥樣硬化保護(hù)作用。ECs 在正常生理條件下會受到規(guī)則的層流剪切應(yīng)力，通過持續(xù)激活 eNOS 來刺激一氧化氮（NO）的釋放。然而，由于OSS的存在，eNOS活性在擾動剪應(yīng)力處降低。

結(jié)果表明，PPP和PU對PE引起的血管收縮有舒張作用，當(dāng)主動脈用 eNOS 抑制劑 L-NAME處理或剝離主動脈內(nèi)皮時，這種作用消失，證明PPP和PU的血管舒張作用是內(nèi)皮依賴性的（圖1 A-D）。這些結(jié)果表明，PPP和PU可能通過改善內(nèi)皮功能發(fā)揮動脈粥樣硬化保護(hù)作用。

圖1   PPP和PU的內(nèi)皮依賴性血管保護(hù)作用。

（A-D）PPP（A）和PU（C）的內(nèi)皮依賴性血管保護(hù)作用和定量結(jié)果（B，D）。

PPP 和 PU 抑制體內(nèi)擾動流誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮中 Smad1/5 的激活

之前的研究表明，在狹窄后的部位，當(dāng)局部血流被OSS（0.5 ± 4 dynes/cm2）干擾時，擾動流可以在狹窄后的部位誘導(dǎo)磷酸化-Smad1/5 的力特異性激活。因此，實驗研究了 PPP 和 PU 是否可以調(diào)節(jié) Smad1/5在體內(nèi)狹窄后位點的這種力特異性激活。使用 U 形夾對大鼠腹主動脈進(jìn)行收縮（圖2 A），對縮窄的主動脈連續(xù)切片的免疫組織化學(xué)檢查表明，狹窄后的部位在管腔 EC 層中表現(xiàn)出高水平的磷酸化-Smad1/5 。相比之下，在收縮的上游和中間點幾乎沒有可檢測到的磷酸化-Smad1/5 染色（圖2 B）。用 PPP 或 PU 處理顯著降低了由狹窄后位點的流動紊亂引起的磷酸化-Smad1/5 的升高（圖2 C、D）。這些結(jié)果表明，PPP 和 PU 可有效抑制體內(nèi)擾動流誘導(dǎo)的 ECs 中 Smad1/5 的力特異性激活。

圖2   PPP和PU抑制由體內(nèi)擾動流誘導(dǎo)的EC中Smad1 / 5的力特異性激活。

（A）通過使用U型夾部分收縮大鼠腹主動脈，建立了腹主動脈狹窄的大鼠模型。采用免疫熒光染色法檢測磷酸化-Smad1/5/vWF/SMα-肌動蛋白在收縮部位上游、中點和下游區(qū)域的蛋白表達(dá)。（B）生理鹽水對照組（C）PPP處理組（D）PU處理組。

PPP 和 PU在體外抑制 OSS 誘導(dǎo)的 ECs 中的 Smad1/5 磷酸化

接下來進(jìn)一步測試了 PPP 或 PU 對 ECs 中 Smad1/5 激活的影響，以響應(yīng) OSS 的干擾流。將 OSS 應(yīng)用于 ECs 可在 24 h 內(nèi)誘導(dǎo) Smad1/5 的持續(xù)磷酸化。與靜態(tài)對照相比，OSS 迅速（4 h）誘導(dǎo) ECs 中 Smad1/5 的磷酸化，并在 24 h 后保持升高。這種 OSS 誘導(dǎo)的 ECs 中 Smad1/5 的磷酸化在 PPP 或 PU 處理后標(biāo)準(zhǔn)化為基礎(chǔ)水平（圖3 A、B）。

先前的研究表明，OSS 誘導(dǎo)的 ECs 中 Smad1/5 的激活是通過激活 BMPRs 來實現(xiàn)的。因此，用骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）處理 ECs 30 分鐘以激活 BMPR 及其下游 Smads 作為對照實驗，以探索 PPP 和 PU 對 ECs 中 BMP 引發(fā)的信號傳導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，PPP 和 PU 顯著抑制了 BMP 誘導(dǎo)的 ECs 中 Smad1/5 的磷酸化（圖3 C）。

圖3   PPP 和 PU 可抑制由OSS 或 BMP 誘導(dǎo)的 ECs中 Smad1/5 的激活。

（A-C）蛋白質(zhì)印跡分析由OSS誘導(dǎo)的ECs中指示分子的蛋白質(zhì)表達(dá)4小時（A）或24小時（B），BMP誘導(dǎo)30分鐘（C）。

PPP 和 PU 抑制 OSS 誘導(dǎo)的 ECs 促炎反應(yīng)

EC炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)病的早期事件，OSS通過觸發(fā)TNF-α等信號分子的釋放來激活EC促炎反應(yīng)，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化進(jìn)展。因此，用 OSS 或 TNF-α處理 ECs 4 h 以刺激 ECs 的促炎狀態(tài)，并檢查 PPP 或 PU 的作用。結(jié)果表明，PPP 和 PU 對 OSS 誘導(dǎo)的 ECs 促炎反應(yīng)具有抑制作用。

PPP 和 PU 抑制 OSS 誘導(dǎo)的 EC 增殖

OSS 誘導(dǎo)的炎癥促進(jìn)了 ECs 的增殖。在暴露于 OSS 24 h后，數(shù)據(jù)表明，PPP 和 PU 可以抑制 Smad1/5 的力特異性激活，從而減弱由 OSS 干擾流動誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)和 ECs 增殖。

PPP 和 PU 抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 VSMC 遷移、表型調(diào)節(jié)和促炎反應(yīng)

由于 VSMCs 的遷移、增殖和表型調(diào)節(jié)是導(dǎo)致動脈粥樣硬化進(jìn)展的關(guān)鍵因素，因此使用傷口愈合實驗檢測了 PPP 和 PU 對 TNF-α 誘導(dǎo)的 VSMCs 遷移的影響。結(jié)果表明，PPP和PU抑制了TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs遷移（圖4 A）。為了進(jìn)一步探索 PU 對 VSMCs 表型調(diào)節(jié)的影響，測定了收縮性 VSMCs 標(biāo)記物，即 SMα-actin 的基因表達(dá)（圖4 B）。結(jié)果表明 SMα-actin 表達(dá)被 TNF-α 降低，并且這種作用被 PU 處理逆轉(zhuǎn)。VSMCs 的合成表型可釋放促炎性 IL-6，而 c-fos 可促進(jìn) VSMCs 增殖。實驗發(fā)現(xiàn)，PU 抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 VSMCs 中 IL-6 和 c-fos 的表達(dá)（圖4 C）。這些結(jié)果表明，PPP 和 PU 可以保護(hù)VSMCs中 TNF-α 誘導(dǎo)的增殖、遷移、炎癥和表型調(diào)節(jié)。所有這些反應(yīng)都參與了動脈粥樣硬化的進(jìn)展。

圖4   PPP和PU抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs的遷移，表型調(diào)節(jié)和炎癥。

（A）通過傷口愈合試驗檢測VSMCs的遷移。（B）蛋白質(zhì)印跡分析及PU對VSMCs中α-SMA表達(dá)的影響的定量結(jié)果。（C）對IL-6和c-fos mRNA表達(dá)的實時熒光定量PCR結(jié)果。

總之，該研究證明 PPP 和 PU 通過抑制 OSS 誘導(dǎo)的增殖和炎癥來保護(hù) EC 功能障礙。PPP 和 PU 的這些保護(hù)作用可能是由于它們抑制了 ECs 中 Smad1/5 的力特異性激活。此外，目前的結(jié)果表明，PPP 和 PU 可以在促炎刺激下抑制 VSMCs 的炎癥、遷移和表型調(diào)節(jié)。研究結(jié)果為 PPP 和 PU 抑制受干擾流/炎癥誘導(dǎo)的 EC 功能障礙和 VSMC 增殖、遷移和表型調(diào)節(jié)，進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化的機(jī)制提供了新的見解。

參考文獻(xiàn)：Anwaier G, Lian G, Ma GZ, Shen WL, Lee CI, Lee PL, Chang ZY, Wang YX, Tian XY, Gao XL, Chiu JJ, Qi R. Punicalagin Attenuates Disturbed Flow-Induced Vascular Dysfunction by Inhibiting Force-Specific Activation of Smad1/5. Front Cell Dev Biol. 2021 Jun 28;9:697539. doi: 10.3389/fcell.2021.697539. PMID: 34262908; PMCID: PMC8273543.

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