胰腺導管腺癌（PDAC）占胰腺癌病例的 90% 以上，PDAC的特征是預(yù)后極差。目前的研究重點是使PDACs的微環(huán)境正?；DAC微環(huán)境的特征是由細胞外蛋白（如膠原蛋白I和透明質(zhì)酸）組成的致密腫瘤相關(guān)基質(zhì)，這些蛋白被重塑以產(chǎn)生僵硬的細胞外基質(zhì)，這種情況稱為纖維增生。

氯沙坦通過其轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）抑制活性，已在臨床上作為靶向致密基質(zhì)的方法進行了測試?；|(zhì)硬度增加也可作為診斷標志物，與預(yù)后不良有關(guān)。它可以激活黏著斑蛋白，如局部黏著斑激酶（FAK）和樁蛋白，以及肌動蛋白細胞骨架重塑蛋白，如RAC，RHO GTPase/Rho相關(guān)激酶（ROCK）和RAS GTPases，以觸發(fā)誘導細胞運動，遷移和侵襲的信號級聯(lián)。此外，在物理受限環(huán)境中的腫瘤生長也導致腫瘤內(nèi)部機械壓縮力的發(fā)展，導致腫瘤內(nèi)壓縮應(yīng)力可達到75 mmHg（10 kPa）。這種類型的機械應(yīng)力已被證明可以激活促進腫瘤發(fā)生和侵襲性的信號通路。

塞浦路斯大學癌癥生物物理學實驗室、美國匹茲堡大學生物工程系、俄勒岡健康與科學大學奈特癌癥研究所等研究團隊的人員假設(shè)機械應(yīng)力激活了在胰腺腫瘤中被持續(xù)激活的信號通路。這些通路包括參與細胞存活和運動調(diào)節(jié)的PI3K/AKT和RAS/MAPK信號級聯(lián)。RAS/MAPK信號通路的增加可能是由于K-Ras是侵襲性胰腺腫瘤中zui常見的突變基因。K-Ras可以激活PI3K / AKT通路，但其主要靶點是MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)，包括c-Jun N端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）。在該團隊以前的研究中，發(fā)現(xiàn)機械應(yīng)力通過激活胰腺癌和腦癌細胞系中的P13K / AKT和MEK1 / ERK1信號級聯(lián)來促進生長分化因子15（GDF15）誘導的癌細胞遷移。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，他們又使用蛋白質(zhì)組學測定來鑒定機械應(yīng)力誘導的信號級聯(lián)反應(yīng)，這可能有助于胰腺癌細胞的運動。研究結(jié)果闡明了機械應(yīng)力誘導的信號傳導機制，并確定限制胰腺癌細胞遷移的治療靶點。

蛋白質(zhì)組學分析揭示了跨多個通路的異質(zhì)反應(yīng)，并揭示了p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun作為胰腺癌細胞中機械應(yīng)力誘導的信號通路的激活

為了研究胰腺癌細胞中機械應(yīng)力誘導的信號通路，實驗分析了在胰腺癌細胞上施加壓縮力后的總蛋白和磷酸化蛋白水平。使用胰腺癌細胞系MIA PaCa-2和PANC-1（攜帶KRAS突變），將 MIA PaCa-2 細胞置于壓力裝置下施加4.0 mmHg的壓縮力。

對照細胞和壓縮細胞之間倍數(shù)變化zui大（20%）的蛋白質(zhì)增加（紅色）或減少（藍色）在熱圖中可視化（圖1 A）。研究發(fā)現(xiàn)，機械應(yīng)力激活了許多調(diào)節(jié)因子，介導細胞適應(yīng)多種應(yīng)激信號，包括熱休克應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥應(yīng)激和氧化應(yīng)激。具體而言，細胞應(yīng)激反應(yīng)介質(zhì)，熱休克蛋白27（HSP27_pS82）及其上游激活劑 p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK_pT180_Y182）在壓縮細胞中表現(xiàn)出與對照細胞相比的強激活，這也通過免疫印跡在 MIA PaCa-2 和 PANC-1 細胞中得到驗證（圖1 B、C、C、E、H）。根據(jù)p38 MAPK的激活，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)蛋白c-Jun JNK的下游靶點c-Jun（pS73）也在壓縮細胞中被激活。隨后通過免疫印跡驗證c-Jun和JNK的激活（圖1 F-H）。細胞應(yīng)激的其他標志物，包括微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3B（LC3）A-B（自噬體標志物）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （ER）應(yīng)激傳感器伴侶免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（BiP）-葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP78）（也稱為 HSP70），也因受到壓縮力而升高（圖1 A）。

在qian10種上調(diào)蛋白中，觀察到與肌動蛋白細胞骨架組織和細胞收縮有關(guān)的纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）的強烈上調(diào)。PAI-1的作用由肌球蛋白II的下游激活介導，它與肌動蛋白絲相互作用形成肌動球蛋白，允許細胞收縮，從而使細胞運動和侵襲。事實上，肌球蛋白II也在壓縮細胞中被激活，如圖1 A。這些介質(zhì)的表達和磷酸化的增加可能有助于在機械壓縮下增強細胞的遷移。

另一方面，機械應(yīng)力下調(diào)了哺乳動物雷帕霉素靶標（mTOR）通路的多個靶點，包括p70-S6K_pT389、Rictor_pT1135、4E-BP1_pS65和mTOR_pS2448，它們促進蛋白質(zhì)合成和細胞生長增殖（圖1 A）。為了評估機械應(yīng)力如何改變信號通路，計算了九個主要通路的通路評分，發(fā)現(xiàn)細胞周期通路的多個蛋白質(zhì)成員（p27_pT157，細胞周期蛋白E1、B1、D1）和結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體（TSC）/mTOR通路減少。相比之下，PI3K/Akt和Ras/MAPK信號通路的蛋白質(zhì)成員升高（圖1 F）。

總的來說，結(jié)果表明，機械應(yīng)力激活細胞應(yīng)激反應(yīng)介質(zhì)和肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)因子，這可能觸發(fā)細胞運動并損害細胞周期進程和增殖。

圖1   進行RPPA實驗以揭示胰腺癌細胞系中機械應(yīng)力誘導的機制。

機械應(yīng)力誘導肌動蛋白細胞骨架重塑和胰腺癌細胞收縮，促進其遷移能力

接下來評估壓縮下MIA PaCa-2和PANC-1胰腺癌細胞系中肌動蛋白細胞骨架組織的變化。實驗觀察到，壓縮的MIA PaCa-2和PANC-1（圖2 A、B）與未壓縮的細胞相比，應(yīng)力纖維、絲狀偽足和片狀偽足形成增加。同時，壓縮細胞的圓度降低，縱橫比增加。此外，發(fā)現(xiàn)壓縮的MIA PaCa-2和PANC-1細胞中的磷酸肌球蛋白II水平增加。壓縮細胞中磷酸肌球蛋白II也與肌動蛋白絲共定位（圖2 C、D），提示肌動球蛋白收縮力增加。

為了評估細胞骨架的這些變化是否促進機械應(yīng)力下的細胞運動，進行了劃傷試驗，發(fā)現(xiàn)與未壓縮的細胞相比，壓縮的PANC-1細胞表現(xiàn)出更高的遷移能力（圖2 E、F）?；诩毎螤罴氶L和遷移增加的結(jié)果，用qPCR分析了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）基因SNAIL、SLUG和TWIST的表達。這些基因在兩種細胞系中均上調(diào)，進一步驗證了壓縮細胞的運動性增強（圖2 G）。

zui后，實驗還檢查了Rac1和cdc42 GTPases的激活，它們通過誘導肌球蛋白II活化來調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架組織以形成細胞突起和肌動球蛋白收縮力。事實上，G-LISA表明，Rac家族小GTPase1（Rac1）早在細胞暴露于壓縮后30分鐘就被激活，而細胞分裂周期因子42（cdc42）GTPase在16小時被激活（圖2 H），這表明可能是機械應(yīng)力誘導的 Rac1/cdc42/肌球蛋白 II 軸的激活。同時，細胞活力試驗和Ki67免疫染色增殖試驗顯示，在壓縮后至少16小時內(nèi)，與對照MIA PaCa-2和PANC-1細胞相比，壓縮后的細胞沒有顯著變化。但壓縮后48小時細胞增殖減少。

總之，結(jié)果表明，在細胞適應(yīng)的前16小時內(nèi)，機械應(yīng)力通過Rac1 / cdc42 / 肌球蛋白II軸和基因表達改變誘導肌動蛋白細胞骨架的變化以觸發(fā)細胞遷移。

圖2   機械應(yīng)力誘導胰腺癌細胞的細胞骨架變化和細胞收縮，促進其遷移能力。

p38 MAPK/HSP27和JNK/c-Jun通路是胰腺癌細胞在機械應(yīng)力下遷移所必需的

為了評估應(yīng)激反應(yīng)通路p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun的激活是否在機械應(yīng)力下細胞遷移潛力的增加中起作用，實驗用p38 MAPK（SB202190）或JNK（SB202190）抑制劑處理MIA PaCa-2和PANC-1細胞。接下來進行了劃痕試驗，觀察到當用任何一種抑制劑在加壓下處理時，MIA PaCa-2和PANC-1癌細胞的遷移顯著減少（圖3 A-C），而當用相同濃度（15 μmol/L）的任一抑制劑處理未壓縮細胞時，未觀察到任何效果。Ki67染色顯示細胞增殖也被有效抑制（圖3 D、E）。為了進一步證實結(jié)果，用siRNA處理p38 MAPK alpha 和JNK1/2的細胞，對siRNA處理的對照和壓縮細胞進行了劃痕測定。實驗觀察到，與各自的未壓縮細胞相比，只有用sip38 MAPK或 siJNK1/2處理的壓縮細胞的遷移能力下降。與細胞遷移的減少和EMT標志物的表達一致，用任一抑制劑處理的壓縮細胞中的肌動蛋白細胞骨架染色顯示細胞突起減少以及應(yīng)力纖維形成。細胞形態(tài)的定量表明，用任何一種抑制劑處理細胞時，細胞長寬比降低，細胞圓度增加。

總的來說，結(jié)果表明，機械應(yīng)力可以導致p38 MAPK和JNK信號通路的激活，這些通路是肌動蛋白細胞骨架重塑和癌細胞遷移所必需的，也是維持壓縮細胞增殖所必需的。

圖3   p38 MAPK/HSP27和JNK/c-Jun通路對于機械應(yīng)力下胰腺癌細胞的增殖和遷移都是必需的。

Rac1-和cdc42-GTPases介導機械應(yīng)力誘導的細胞骨架變化，促進胰腺癌細胞遷移

因為機械應(yīng)力會誘發(fā)細胞突起、絲狀偽足和片狀偽足（圖2 A、B），并且由于這些結(jié)構(gòu)受RAC1和cdc42小GTPases 的調(diào)節(jié)，實驗用針對RAC1和CDC42的siRNA處理MIA PaCa-2和PANC-1細胞，并進行劃痕愈合實驗和鬼筆環(huán)肽染色，以檢查它們在介導壓縮效應(yīng)中的作用。確認這些基因的成功敲低（圖4 A、B），觀察到siRac1處理的細胞對傷口閉合的強烈抑制，而在sicdc42處理的細胞中作用較弱（圖4 C-E）。此外，肌動蛋白應(yīng)激纖維、絲狀偽足和片狀偽足形成減少，細胞縱橫比減少，細胞圓度增加。同時還發(fā)現(xiàn)，盡管肌球蛋白II在siRNA處理的壓縮細胞中被激活，但肌動球蛋白的形成減少。

為了確定RAC1和CDC42下調(diào)與JNK或p38 MAPK激活之間的相互作用，進行了免疫印跡，發(fā)現(xiàn)JNK和p38 MAPK激活在RAC1或CDC42敲低后不受影響。此外，用siRac1或sicdc42處理不影響MIA PaCa-2或PANC-1細胞的增殖（圖4 F）。

總的來說，結(jié)果表明，p38 MAPK和JNK在機械應(yīng)力下的激活，維持細胞活力，并不依賴于Rac1和cdc42 GTPases，而這些GTPases 是肌動蛋白細胞骨架重組和細胞運動所必需的。

圖4   Rac-1-和cdc42-小GTP酶介導機械應(yīng)激誘導的胰腺癌細胞遷移。

圖5    圖形概要

機械應(yīng)力誘導的信號通路，驅(qū)動胰腺癌細胞遷移。在宿主組織的受限環(huán)境中，胰腺腫瘤生長過程中會產(chǎn)生機械壓縮力。這些力通過激活JNK / c-Jun，p38 MAPK / HSP27，Rac1和cdc42在細胞內(nèi)傳遞各自的固體應(yīng)力。p38 MAPK/HSP27和JNK/c-Jun信號軸的激活可以通過驅(qū)動細胞在壓縮下的增殖來調(diào)節(jié)細胞對新環(huán)境的適應(yīng)。Rac1和cdc42依次被激活，并且可以調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架重塑，以形成逐漸改變細胞形狀的細胞突起。Rac1和cdc42也介導肌動球蛋白收縮性，zui終在壓縮下促進胰腺癌細胞遷移。

總的來說，該研究結(jié)果建立了一種新的機制，通過激活p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun信號軸以及肌動蛋白細胞骨架重塑因子Rac1，cdc42和肌球蛋白II 來促進腫瘤進展。研究結(jié)果強調(diào)，靶向適應(yīng)機械腫瘤微環(huán)境的腫瘤細胞中的異常信號是一種阻止腫瘤遷移的新方法。

參考文獻：Kalli M, Li R, Mills GB, Stylianopoulos T, Zervantonakis IK. Mechanical Stress Signaling in Pancreatic Cancer Cells Triggers p38 MAPK- and JNK-Dependent Cytoskeleton Remodeling and Promotes Cell Migration via Rac1/cdc42/Myosin II. Mol Cancer Res. 2022 Mar 1;20(3):485-497. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-21-0266. PMID: 34782370; PMCID: PMC8898300.

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