牙周膜細胞（PDL）細胞是牙周再生治療的有前途的工具。獲得足夠數(shù)量的PDL細胞對于PDL再生至關重要。PDL細胞的再生潛力已經(jīng)在大型動物模型中進行了研究，并報道了其臨床結果。然而，由于它們對組織資源和增殖能力的限制，開發(fā)有效的方法來擴增PDL細胞以進行牙周再生至關重要。

PDL位于牙槽骨和牙骨質之間，它持續(xù)感知機械力，例如正畸牙齒移動（OTM）或咀嚼過程中的拉伸應力、壓應力和剪切應力。PDL細胞感知并響應機械應力，這對于組織穩(wěn)態(tài)和重塑至關重要。

YAP是Hippo通路的共轉錄因子，在細胞增殖、遷移和分化中起重要作用。此外，YAP還具有機械轉導特性。有研究報道，細胞骨架張力可以調節(jié)zyxin 蛋白，其介導人PDL成纖維細胞中YAP的核轉運。然而，YAP是否參與剪切應力介導的PDL細胞增殖以及上游調節(jié)因子尚不清楚。

基于此，北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院北京生物醫(yī)學工程高精尖中心、生物力學與力學生物學教育部重點實驗室的一項研究探討了流體剪切應力（FSS）介導的牙周膜細胞增殖機制，研究結果為PDL細胞增殖作為PDL組織再生的可行方法提供了新的見解，對p38-AMOT-YAP機械轉導的觀察為牙齒運動和牙齒矯形提供了啟示。

FSS促進PDL細胞增殖并重排細胞骨架和核形狀

為了研究FSS對PDL細胞增殖的影響，用1、3、6和9 dyn/cm2的 FSS 持續(xù)4小時來量化EdU陽性PDL細胞。在這項研究中，1-6 dyn/cm2的FSS促進細胞增殖，但9 dyn/cm2的FSS抑制細胞增殖。此外，6 dyn/cm2 的FSS效果zui'好，EdU陽性細胞的數(shù)量從24.41%±4.01%增加到43.13%±6.03%（圖1 A、B）。因此，實驗選擇了 6 dyn/cm2的FSS在隨后的實驗中。

將PDL細胞暴露于6 dyn/cm2的FSS，與靜態(tài)對照相比，細胞保持了更高的活力（圖1 C）。為了研究FSS對PDL細胞骨架重塑的影響，將PDL細胞暴露于6 dyn/cm2 FSS中持續(xù)5分鐘，10分鐘，30分鐘，1小時，2小時和4小時，結果增加了F-肌動蛋白絲的密度（圖1 D、E）。投影面積減小，細胞形狀指數(shù)呈時間依賴性增加（圖1 F、G），表明FSS可以將細胞形狀改變?yōu)楦「鼒A。接下來，研究了FSS介導的細胞粘附。有趣的是，F(xiàn)SS似乎在二相模型中調節(jié)FAK和Paxillin。它在1-5分鐘后增加了FAK和Paxillin的長度。然而，這些參數(shù)在FSS超過30分鐘后下降（圖1 D、H）。

當FSS持續(xù)5分鐘-4小時時，核厚度在10分鐘內下降，并在30分鐘后增加。核面積在10分鐘內增加，并在30分鐘后降低（圖1 I-K）。然而，F(xiàn)SS沒有改變核體積（圖1 L），表明在FSS的10分鐘內，細胞核變得更平坦，但在30分鐘后，它們達到了更立體的形狀。肌動蛋白帽在10 分鐘內增加，30 分鐘后減小（圖1 M、N），肌動蛋白帽的總熒光強度與核厚度呈高度相關（圖1 O），表明FSS促進肌動蛋白帽擴增和壓縮細胞核。然后進一步研究了FSS在10分鐘內對核孔的影響。結果表明，5-10 分鐘的FSS擴張了核孔徑（圖1 P、Q）。

圖1   FSS促進PDL細胞增殖，重新排列細胞骨架，改變細胞核形狀。

YAP參與FSS誘導的PDL細胞增殖

接下來研究了YAP在FSS誘導的PDL細胞增殖中的作用。結果表明，YAP在FSS的持續(xù)時間內顯示出動態(tài)易位。它們在5-10分鐘內響應FSS在細胞核中積聚。然而，在FSS持續(xù)的30分鐘、1小時、2小時或4小時后，YAP被排除在細胞核之外。YAP比值的N/C與核厚度高度相關，表明核形狀的變化影響YAP核定位。核轉運抑制劑（LMB）阻斷FSS誘導的YAP轉錄輸出1小時，這表明核孔輸出對于FSS誘導的YAP至關重要。YAP的Ser127是LATS1/2的關鍵靶點，F(xiàn)SS將其下調。YAP靶基因，如CTGF和ANKRD30，在4 分鐘-2 小時FSS下被促進，表明下游基因被FSS持續(xù)激活。這些結果表明，盡管FSS誘導的YAP定位是動態(tài)的，但下游基因的激活及其抑制的磷酸化持續(xù)存在。當敲低YAP時，F(xiàn)SS誘導的細胞增殖被阻斷。這些結果表明，F(xiàn)SS調控的YAP在FSS誘導的PDL細胞增殖中起關鍵作用。

LATS1/2是調節(jié)Hippo 通路中YAP激活的上游激酶。數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)SS可以調節(jié)LATS1/2活性，從而調節(jié)YAP的定位和激活。當LATS1/2沉默時，即使在對照細胞中，F(xiàn)SS也未能促進細胞增殖。這些結果表明，LATS參與FSS誘導的YAP調控，并在FSS誘導的PDL細胞增殖中發(fā)揮作用。

p38通過調節(jié)PDL細胞中的LATS和YAP來調節(jié)FSS誘導的細胞增殖

據(jù)報道MAPK信號通路可調節(jié)YAP活性。在研究中，6 dyn/cm2 的FSS可以在5-30分鐘內快速激活ERK、p30和JNK。當PDL細胞分別用ERK，p38和JNK抑制劑預處理時，p38抑制劑（而不是JNK和ERK抑制劑）減少了FSS誘導的YAP核聚集。被FSS降低的pYAP表達被p38抑制劑恢復，但JNK或ERK抑制劑不能。CTGF和ANKRD1的表達也有類似的趨勢。因此進一步研究了p38的作用，發(fā)現(xiàn)FSS誘導的增殖被p38抑制劑顯著破壞，但JNK和ERK抑制劑沒有。由于FSS下調了pLATS1，實驗發(fā)現(xiàn)只有p38抑制劑可以在FSS下挽救pLATS1表達。這些結果表明，p38通過抑制LATS磷酸化和促進YAP活性來調節(jié)FSS誘導的細胞增殖。

細胞骨架和LINC調控FSS誘導的YAP定位

已知YAP受細胞骨架高度調控。為了研究細胞骨架在FSS誘導的YAP定位中的作用，使用不同的細胞骨架抑制劑：細胞松弛素D（Cyto D）、Rho激酶抑制劑Y-27632、非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制劑Bleb，以干擾細胞骨架的不同方面。結果表明，F(xiàn)SS下肌動蛋白絲受損符合YAP的核排出。相反，當細胞與促進肌動蛋白聚合的誘導劑Jasp孵育時，F(xiàn)SS誘導的YAP的核定位增加（圖2 A、B），表明肌動蛋白絲的完整性在FSS誘導的YAP定位中起重要作用。這些細胞骨架試劑也調節(jié)細胞核形狀。細胞骨架抑制劑受損提高了核高度并減少了核面積。然而，Jasp具有相反的效果（圖2 C-F）。已知LINC復合物將力從細胞質細胞骨架傳遞到細胞核。當沉默將肌動蛋白連接到LINC的nesprin1時，F(xiàn)SS誘導的F-肌動蛋白形成和YAP核定位受到阻礙（圖2 G、H）。當nesprin1被敲低時，F(xiàn)SS促進的F-肌動蛋白和paxillin 也降低（圖2 I）。沉默的nesprin1取消了FSS增加的肌動蛋白帽和核扁平化（圖2 J-O）。這些結果表明，LINC對于FSS從細胞骨架到細胞核的轉導至關重要，它參與了FSS誘導的YAP轉運。

圖2   細胞骨架和LINC參與PDL細胞中FSS誘導的YAP定位。

p38 影響 Akt/cofilin 和 LATS 以調節(jié) FSS 誘導的 PDL 細胞中 F-肌動蛋白聚合

Akt和cofilin是調節(jié)肌動蛋白聚合的關鍵因子。實驗結果表明，在FSS作用5-30分鐘后，pAkt/Akt的表達增加，而Akt表達沒有變化（圖3 A）。此外，pcofilin/cofilin的水平也在FSS作用5-30分鐘后上調，而cofilin水平?jīng)]有影響（圖3 B）。當cofilin沉默時，F(xiàn)SS上調YAP核定位，下游基因表達進一步增加，趨勢與F-肌動蛋白形成相同（圖3 C-G）。當使用Akt抑制劑MK2206和PI3K抑制劑LY294002時，F(xiàn)SS誘導的pcofilin表達受到抑制（圖3 H）。當PDL細胞與p38抑制劑預培養(yǎng)并加載6 dyn/cm2的FSS 時，pAkt/Akt和pcofilin/cofilin，F(xiàn)-肌動蛋白的水平降低（圖3 I-L）。這表明，p38對肌動蛋白聚合至關重要。

為了證明LATS1和Akt的關系，將MK-2206與PDL細胞一起孵育以抑制Akt活性。結果表明，被FSS降低的pLATS1/LATS1表達被Akt抑制劑恢復（圖3 M）。相反，敲低LATS1/2幾乎沒有影響FSS介導的Akt活性。由于p38可以抑制pLATS水平，因此當沉默LATS1/2，F(xiàn)-肌動蛋白密度增加，并且對FSS沒有反應（圖3 N、O）。當LATS1/2被敲低時，對照組中肌動蛋白帽增加，F(xiàn)SS不能增強（圖3 P、Q）。沉默LATS1/2進一步增加了FSS誘導的核扁平化，對FSS調節(jié)沒有反應（圖3 R-U）。這些結果表明，F(xiàn)SS激活了p38，隨后激活了Akt，Akt磷酸化cofilin，促進了F-肌動蛋白聚合。Akt的激活參與了LATS磷酸化的抑制。受p38抑制的LATS負調節(jié)F-肌動蛋白，肌動蛋白帽形成和核扁平化。因此，F(xiàn)SS誘導的F-肌動蛋白聚合增加了YAP核易位。

圖3   p38影響Akt/cofilin和LATS調節(jié)FSS誘導的PDL細胞中F-肌動蛋白聚合。

AMOT負調節(jié)FSS誘導的PDL細胞中YAP轉運

據(jù)報道，AMOT家族可以與幾種Hippo 通路成分相互作用并調節(jié)YAP活性。有趣的是，這些研究表明AMOT被轉運到細胞核中，其模式類似于FSS誘導的YAP定位。AMOT N/C比相對于核厚度較高。FSS在5-10分鐘內抑制AMOT的磷酸化。當沉默AMOT時，YAP核定位增加，對FSS沒有反應。下游基因，如CTGF和ANKRD1，表現(xiàn)出相同的趨勢。AMOT的敲低促進了FSS誘導的PDL細胞增殖。當AMOT被沉默時，F(xiàn)SS加速增殖不受FSS調控。這表明AMOT是一種負調節(jié)因子，是FSS誘導的YAP核定位和細胞增殖所必需的。為了研究潛在的機制，實驗研究了AMOT與F-肌動蛋白和YAP的相互作用。結果表明，F(xiàn)SS可以增加AMOT與F-肌動蛋白的結合并減少AMOT-YAP相互作用。當沉默YAP時，AMOT-F-肌動蛋白相互作用在FSS下進一步增強。當通過Bleb抑制F-肌動蛋白聚合時，AMOT-YAP相互作用得到促進。當使用Jasp時，在FSS下AMOT-YAP相互作用降低。這些結果表明，AMOT可以與F-actin和YAP競爭性結合。F-肌動蛋白的聚合促進了AMOT與F-肌動蛋白的相互作用。

為了進一步研究AMOT的調控機制，實驗發(fā)現(xiàn)siYAP抑制了FSS介導的AMOT核定位（圖4 A、B）。當使YAP陰性調節(jié)因子LATS1/2沉默時，AMOT核定位增加并且對FSS沒有反應（圖4 C、D）。siLATS1/2也降低了它們的磷酸化（圖4 E），表明LATS1/2可以調節(jié)pAMOT和FSS誘導的核定位。AMOT還可以調節(jié)LATS1的磷酸化。當沉默AMOT時，F(xiàn)SS抑制的磷酸化進一步下降，并且不再受FSS調節(jié)（圖4 F）。這些結果表明，F(xiàn)SS抑制pLATS1，影響pAMOT及其核定位。AMOT可以磷酸化LATS1。AMOT的核定位部分取決于YAP核轉運（圖4 G）。

圖4   YAP和LATS調節(jié)FSS誘導的AMOT磷酸化和定位。

（G）FSS如何調節(jié)p38并進一步影響YAP核易位以促進PDL細胞增殖的示意圖。

在這項研究中，報道了FSS可以通過p38-AMOT-YAP促進PDL細胞增殖。FSS激活p38，抑制pLATS并上調YAP活性。此外，F(xiàn)SS誘導的p38表達還激活了Akt和pcofilin，促進了肌動蛋白帽和F-肌動蛋白聚合，使細胞核變平，擴增了核孔徑，從而增加了YAP核易位。F-肌動蛋白招募AMOT進行結合并從YAP-AMOT復合物中釋放YAP。研究結果表明，F(xiàn)SS是PDL細胞擴增的有前途的工具，還揭示了YAP機械轉導的分子機制，這將有利于未來的牙齒再生。

參考文獻：Shi Q, Zheng L, Na J, Li X, Yang Z, Chen X, Song Y, Li C, Zhou L, Fan Y. Fluid shear stress promotes periodontal ligament cells proliferation via p38-AMOT-YAP. Cell Mol Life Sci. 2022 Oct 16;79(11):551. doi: 10.1007/s00018-022-04591-w. PMID: 36244032.

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