在體內，最佳的T細胞活化既是一個機械過程，也是一個生化過程。Piezo1是一種機械敏感離子通道，響應物理力，例如流體剪切應力（FSS）而開放，并允許鈣離子內流。鈣內流導致 Piezo1 將物理刺激轉化為生化反應，因為鈣是參與多種信號通路的第二信使。其中一條通路是T細胞活化，因為鈣內流會增加活化T細胞核因子（NFAT）、核因子κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1）的活化。然后，這些轉錄因子誘導細胞因子的產生，這些細胞因子在持續(xù)的T細胞活化、分化和細胞毒性中起重要作用。先前的一項研究表明，流體剪切應力（FSS）誘導單個T細胞中的鈣內流，這表明通過Piezo1激活的FSS可能具有促炎作用。

在美國范德堡大學生物醫(yī)學工程系的一項研究中，用FSS處理Jurkat和原代人T細胞，通過以0.5-5.0 dyn/cm2的FSS 梯度處理T細胞來研究生理性FSS的效果。然而，在病理生理學背景下，高血壓的血壓異常屬于血流動力學的改變，與細胞因子水平異常相關，并與多種自身免疫性疾病相關。在高血壓患者血管網絡的某些區(qū)域，血流速度降低，F(xiàn)SS降低。在其他區(qū)域，血流速度增加，F(xiàn)SS升高。了解FSS與改變的T細胞活化之間的關系可以為高血壓患者自身免疫性疾病的治療確定新的治療靶點。這項研究是第一個確定FSS增強T細胞活化的研究，觀察結果表明，Piezo1和其他機械敏感離子通道可能是自身免疫性疾病的治療靶點，或用于改善過繼性T細胞免疫療法。

FSS 增強用 CD3/CD28 抗體處理的 Jurkat 細胞中的 ZAP70 磷酸化

利用永生化Jurkat細胞系，模擬CD3 / CD28抗體聯(lián)合體外FSS（5.0 dyn/cm2，1h）對T細胞的激活作用（圖1 A）。在整個FSS實驗中，將剪切應力值保持在靜脈和動脈水平，分別為0.5-4.0 dyn/cm2和 4.0-30.0 dyn/cm2。為了確定FSS暴露水平是否對細胞具有細胞毒性，測量了細胞活力。5.0 dyn/cm2 的FSS持續(xù)1小時未顯著降低細胞活力。

首先用不含抗體的FSS處理Jurkat細胞，以確定單獨FSS的激活作用。通過測量zeta鏈相關蛋白激酶-70（ZAP70）磷酸化來量化，ZAP70 在CD3激活后磷酸化，是T細胞活化的必要步驟。與靜態(tài)對照相比，單獨的FSS僅導致ZAP70磷酸化增加10%（圖1 B）。當CD3/CD28抗體與FSS聯(lián)合時，與僅抗體或未處理的對照相比，ZAP70磷酸化顯著增加，約50%（圖1 C）。然后用不同幅度的FSS處理Jurkat細胞，以確定T細胞活化對剪切應力的“幅度反應"。實驗觀察到ZAP70磷酸化的增加與FSS幅度呈正相關（圖1 D）。此外，還測量了Jurkat ZAP70磷酸化對FSS-抗體處理時間的依賴性。隨著FSS持續(xù)時間的增加，ZAP70磷酸化顯著增加（圖1 E）。

圖1   CD3 / CD28抗體和FSS處理對ZAP70的磷酸化作用。

FSS 聯(lián)合 CD3/CD28 抗體可增加 Jurkat 細胞中晚期 T 細胞活化標志物的表達

為了正常激活T細胞，需要激活轉錄因子NFAT、NF-κB和AP-1來轉錄重要的蛋白質和細胞因子，例如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-2和干擾素γ（IFN-γ）。實驗用FSS聯(lián)合CD3/ CD28抗體刺激Jurkat細胞1小時后測量每個轉錄因子的活化。結果觀察到，NFAT-核共定位顯著增加（圖2 A），而且FSS與CD3 / CD28抗體的組合顯著增加了NF-κB和AP-1的活化。

FSS處理1小時后測量細胞因子TNF-α，IL-2和IFN-γ的表達，以確定三種轉錄因子的激活增加是否與維持T細胞功能和激活所需的蛋白質表達增加相關。與對照組相比，當Jurkat細胞用FSS處理1小時時，每種細胞因子的表達均顯著增加。FSS處理后24小時后測量了活化標志物CD69和CD25的表達。與對照組相比，F(xiàn)SS-抗體處理組和僅抗體處理組均顯示CD69和CD25表達增加。

FSS下CD3 / CD28抗體包被珠增加了Jurkat細胞的活化

實驗還用CD3 / CD28抗體包被的磁珠測試了FSS，以確定FSS是否也可以增強使用磁珠激活的Jurkat細胞的活化。用或不用FSS聯(lián)合抗體包被的磁珠刺激Jurkat細胞1小時。與僅磁珠和未處理的對照相比，F(xiàn)SS處理顯著增加了ZAP70的磷酸化。與未處理的對照相比，單獨磁珠對照組的ZAP70磷酸化也顯著增加，但不如FSS處理組明顯（圖2 A）。此外，在用磁珠處理1小時后FSS也顯著增強了轉錄因子NF-κB和cFOS的磷酸化。單獨磁珠對照組僅顯著增加了cFOS的磷酸化，而不是NF-κB（圖2 B、C）。當用CD3 / CD28包被珠處理Jurkat細胞時，F(xiàn)SS也顯著增加了Jurkat細胞的細胞因子表達。與對照組相比，TNF-α、IL-2和IFN-γ在FSS條件下均大幅上調（圖2 D）。

圖2   FSS通過CD3 / CD28包被磁珠增加活化。

FSS增強Jurkat細胞中T細胞的活化具有Piezo1 和鈣依賴性

為了確定FSS增強的T細胞活化是否通過鈣內流起作用，在無鈣或含鈣的HBSS緩沖液中用抗體加FSS的組合處理Jurkat細胞1小時。用FSS和抗體在含鈣緩沖液中處理的Jurkat細胞顯示出ZAP70磷酸化顯著增加。在無鈣緩沖液中用FSS和抗體處理的Jurkat細胞沒有顯示出ZAP70磷酸化的顯著增加（圖3 A）。接下來，用或不用鈣螯合劑EGTA以2mM的濃度預處理Jurkat細胞30分鐘，觀察到用EGTA，F(xiàn)SS和抗體處理的Jurkat細胞ZAP70磷酸化顯著降低（圖3 B）。

為了確定Piezo1是否可能在FSS增強的T細胞活化中發(fā)揮作用，實驗在FSS和抗體處理前30分鐘用10 μM GsMTx-4 處理Jurkat細胞。GsMTx-4是Piezo1的相對特異性抑制劑，但已知也會抑制其他機械敏感通道。GsMTx-4導致用FSS和抗體處理的Jurkat細胞的ZAP70磷酸化顯著降低（圖3 C）。這表明FSS通過誘導導致鈣內流的機械敏感離子通道的激活來增強T細胞活化。為了更具體地量化Piezo1是負責FSS增強Jurkat細胞活化的離子通道的程度，利用CRISPR/Cas9技術敲除Jurkat細胞中Piezo1。在Jurkat Piezo1 敲除細胞中，與未處理或僅抗體處理的細胞相比，F(xiàn)SS處理不會增加ZAP70磷酸化。然而，在Cas9對照Jurkat細胞中，F(xiàn)SS處理顯著增加了ZAP70磷酸化。此外，當兩者都用FSS處理時，與Jurkat Piezo1 敲除細胞相比，Cas9對照Jurkat細胞中的ZAP70磷酸化顯著更高（圖3 D）。

實驗還研究了鈣內流的下游效應，以確定它們是否在FSS存在下增強T細胞活化方面發(fā)揮作用。肌動蛋白聚合先前已被確定為有效T細胞活化所必需的，并受鈣內流調節(jié)。在FSS處理前30分鐘用30 μM細胞松弛素D（CCD）預處理Jurkat細胞以抑制肌動蛋白聚合。CCD顯著降低了與FSS-抗體處理相關的增加的ZAP70磷酸化，同時在僅抗體條件下沒有顯著改變Jurkat細胞的活化（圖3 E）。

鈣調磷酸酶是一種磷酸酶，在鈣內流下游被激活，并與NF-κB激活有關。為了確定鈣調磷酸酶是否被鈣內流激活以增加轉錄因子活化，通過用5 μM環(huán)孢菌素A（CSA）預處理Jurkat細胞30分鐘來抑制鈣調磷酸酶。CSA處理顯著降低了用FSS和抗體處理的Jurkat細胞中的NF-κB磷酸化，表明FSS激活鈣調磷酸酶以促進轉錄因子的激活（圖3 F）。

圖3   鈣內流對于Jurkat細胞中FSS增強T細胞激活至關重要。

FSS增強原代T細胞的活化

為了獲得更生理性的T細胞活化模型，并確定FSS處理的活化效果是否與臨床中的T細胞療法相關，實驗用抗體和FSS處理原代人T細胞1小時。FSS增強了CD4和CD8-陽性T細胞亞群中ZAP70的磷酸化。這種趨勢在NF-κB磷酸化中也很明顯，CD4和CD8陽性T細胞的NF-κB磷酸化顯著增加。如上所述，細胞因子表達是T細胞活化和功能的另一個重要步驟。因此，F(xiàn)SS處理1小時后，測量兩個亞群中原代T細胞的TNF-α，IL-2和IFN-γ的表達。在CD4和CD8陽性T細胞中，與未處理和僅抗體的對照相比，用FSS和CD3 / CD28抗體處理T細胞時，所有三種細胞因子均顯著增加。

圖4   FSS和CD3 / CD28抗體增強T細胞活化的示意圖。

FSS激活Piezo1，使鈣流入。鈣內流增加ZAP70磷酸化，并激活轉錄因子NFAT，NF-κB和AP-1。這反過來又導致細胞因子（如IL-2）的表達增加。

總之，該研究表明，5.0 dyn/cm2的生理FSS當受到CD3/CD28抗體刺激時可以增強T細胞的活化。然而，該研究結果也可能與病理生理狀態(tài)有關，如高血壓。實驗發(fā)現(xiàn)，通過ZAP70磷酸化測量，F(xiàn)SS幅度的增強進一步增加了T細胞活化。高血壓與身體某些部位（如左右頸總動脈和冠狀動脈）的血流速度增加有關，因此FSS增加。在這些疾病中，已知T細胞都起著重要作用。這項研究的結果以及高血壓與自身免疫性疾病之間的相關性表明，抑制T細胞中的Piezo1和其他機械敏感離子通道可能對自身免疫性疾病和細胞因子釋放綜合征具有治療潛力。

參考文獻：Hope JM, Dombroski JA, Pereles RS, Lopez-Cavestany M, Greenlee JD, Schwager SC, Reinhart-King CA, King MR. Fluid shear stress enhances T cell activation through Piezo1. BMC Biol. 2022 Mar 9;20(1):61. doi: 10.1186/s12915-022-01266-7. PMID: 35260156; PMCID: PMC8904069.