在過去的幾十年中，人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（ASCs）的多向分化能力因其在基于干細(xì)胞的治療策略中的潛在應(yīng)用而得到了廣泛的研究。目前正在探索基于干細(xì)胞的療法來治療眼部疾病，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR），其中血管并發(fā)癥導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障（BRB）破壞。

微循環(huán)損傷主要?dú)w因于周細(xì)胞的不可逆丟失，這是DR的早期標(biāo)志，因?yàn)樵诔扇艘暰W(wǎng)膜中，周細(xì)胞無法復(fù)制。高血糖引起的活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生刺激炎癥過程，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管損傷。在DR患者中發(fā)現(xiàn)不同炎性細(xì)胞因子（如IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平升高。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和大膠質(zhì)細(xì)胞參與這些細(xì)胞因子的分泌，其積累有助于神經(jīng)元死亡。此外，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管生成素-2等促血管生成因子已被證明可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致血管通透性增加和破裂。

基于干細(xì)胞的療法可能是抵消周細(xì)胞丟失和減緩疾病進(jìn)展的寶貴工具。體外實(shí)驗(yàn)和DR小鼠模型曾報(bào)道了令人鼓舞的結(jié)果。在意大利卡塔尼亞大學(xué)生物醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)科學(xué)系團(tuán)隊(duì)之前的體外研究中，通過在專為周細(xì)胞（PM）設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ASCs，實(shí)現(xiàn)了ASCs的周細(xì)胞樣分化。結(jié)果，獲得了平滑肌肌動(dòng)蛋白α（α-SMA）和神經(jīng)膠質(zhì)抗原2（NG2）的過表達(dá)，以及它們典型的腎小管周圍定位。此外，周細(xì)胞樣分化ASCs和人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（HRECs）的共培養(yǎng)誘導(dǎo)了連接蛋白的表達(dá)增加。它們也將被稱為pmASCs，因?yàn)樗鼈兊姆只^程也是通過使用PM實(shí)現(xiàn)的。

該團(tuán)隊(duì)下一項(xiàng)研究的目的是進(jìn)一步探索通過相同分化方案獲得的這些pmASCs的行為，特別是，為了模擬糖尿病患者發(fā)生的狀況，在向培養(yǎng)基中加入葡萄糖后測量和比較各種參數(shù)。實(shí)驗(yàn)評(píng)估了細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力及其遷移能力；還測量了ROS的產(chǎn)生以及促炎（TNF-α和IL-1β）和抗炎（TGF-β1和IL-10）細(xì)胞因子、促血管生成因子（VEGF，血管生成素-2和MMP-9）的mRNA表達(dá)；最后通過3D共培養(yǎng)評(píng)估了pmASC對(duì)HREC組織管狀形成能力的影響。在這些結(jié)果中獲得的周細(xì)胞樣ASCs代表了治療糖尿病患者視網(wǎng)膜損傷的寶貴數(shù)據(jù)。

首先，進(jìn)行細(xì)胞增殖和活性檢測。盡管存在顯著差異，但在所有測試的ASC群體中均觀察到高增殖率。圖1顯示了所研究的所有四個(gè)亞組中典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。可以觀察到，無論葡萄糖濃度如何，pmASC培養(yǎng)物中存在更密集的細(xì)胞群（圖1 B、D），在較長時(shí)間內(nèi)可能會(huì)注意到輕微下降。添加葡萄糖對(duì)這些細(xì)胞種群的影響不顯著。相反，高葡萄糖濃度對(duì)人視網(wǎng)膜周細(xì)胞（HRPCs）的增殖率產(chǎn)生負(fù)面影響，其增殖率逐漸降低，特別是在葡萄糖添加72小時(shí)。通過MTT測定細(xì)胞活力，pmASCs與ASCs在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的任何葡萄糖濃度下都顯示出相似的高值，相反，在HRPC種群中測量到較低值，添加葡萄糖48小時(shí)和72小時(shí)后逐漸觀察到顯著下降。

圖1    在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（ASC）或周細(xì)胞培養(yǎng)基（pmASC）中培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的代表性顯微照片，在細(xì)胞增殖測定期間用結(jié)晶紫染色。在各自的培養(yǎng)基中生長三天后，在一些樣本（高葡萄糖，25 mM）中添加葡萄糖，而其他樣本則保持在正常葡萄糖（NG）狀態(tài)。在葡萄糖添加72小時(shí)后拍攝照片，并與NG對(duì)照進(jìn)行比較。四個(gè)亞組為A：ASC NG；B: pmASC NG；C: ASC HG；D: pmASC HG。

接下來，與HRPCs相比，進(jìn)行了傷口愈合測定以評(píng)估不同ASC亞組的細(xì)胞遷移能力（圖2 A）。數(shù)據(jù)顯示，在NG條件下培養(yǎng)時(shí)，ASCs和pmASCs在48小時(shí)的觀察期內(nèi)表現(xiàn)出顯著的遷移能力，傷口愈合率約為70%（圖2 B）。將葡萄糖加入培養(yǎng)基（HG）時(shí)觀察到顯著差異，與pmASCs相比，ASCs（傷口愈合率約為35%）明顯顯示出相反的趨勢(shì)。在傷口愈合率約為70% 的HRPCs 中觀察到中間值（圖2 C）。HG條件下，pmASCs的相關(guān)細(xì)胞遷移能力在48小時(shí)時(shí)尤為明顯。

圖2    通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基（ASC）或周細(xì)胞培養(yǎng)基（pmASC）中培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞以及人視網(wǎng)膜周細(xì)胞（HRPC）培養(yǎng)物中的傷口愈合測定評(píng)估細(xì)胞遷移能力。（A）在劃痕（0小時(shí)），培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后每個(gè)樣品的代表性照片。量化ASC和pm ASC培養(yǎng)（B）和HRPC培養(yǎng)（C）的傷口愈合百分比。

然后評(píng)估了每個(gè)ASC亞組和HRPC群的ROS水平，在觀察期內(nèi)，ASC種群中ROS水平逐漸增加，而pmASCs在每個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)檢測到穩(wěn)定且顯著降低的水平。加入葡萄糖后，每個(gè)ASC組內(nèi)未觀察到明顯變化，而在HRPC培養(yǎng)組中觀察到不同的趨勢(shì)，72小時(shí)后觀察到其顯著更高的ROS水平。

在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，在NG和HG條件下，通過定量RT-PCR分析ASC和pmASC培養(yǎng)物中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平（圖3）。在NG條件下培養(yǎng)時(shí)，ASCs和pmASCs之間的抗炎細(xì)胞因子IL-10 mRNA表達(dá)沒有明顯差異，而在HG條件下，ASC培養(yǎng)物中略高的IL-10 mRNA水平在pmASCs中增加了25倍。此外，與ASC培養(yǎng)物相比，pmASC培養(yǎng)物中的TGF-β1 mRNA水平升高，特別是在HG條件下。在NG條件下ASC和pmASC培養(yǎng)物中檢測到相似的促炎細(xì)胞因子TNF-α mRNA水平，而在HG條件下，與ASCs中更顯著的增加相比，pmASC僅觀察到微弱升高的水平。與ASCs相比，NG條件下的IL-1β mRNA水平在pmASC中顯著降低，而在HG培養(yǎng)中，ASCs中測量的水平較低，而pmASCs中沒有顯著差異。

此外，評(píng)估了血管生成因子VEGF，血管生成素-2和MMP9的mRNA表達(dá)水平。在HG培養(yǎng)的ASC中，VEGF和血管生成素-2值均增加，而在pmASCs中的較低水平未受顯著影響。MMP9 mRNA在NG條件下水平較低，添加葡萄糖后在ASCs中顯著更高，在pmASCs中甚至更低。這些數(shù)據(jù)表明，炎癥基因的調(diào)節(jié)有利于抗炎表型，同時(shí)，血管生成因子普遍降低。

圖3    高葡萄糖對(duì)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（ASC）或周細(xì)胞培養(yǎng)基（pmASC）中培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中的抗炎和促炎細(xì)胞因子以及血管生成因子的影響。通過qRT-PCR評(píng)估IL 10（A）、TGF-β1（B）、TNFα（C）、IL-1β（D）、VEGF（E）、血管生成素-2（F）和MMP9（G）mRNA水平的定量分析。

最后，在3D共培養(yǎng)中測試了HRECs與ASCs或pmASCs之間的相互作用，分析了HREC自組裝的管狀結(jié)構(gòu)引起的修飾（圖4 A）。定量數(shù)據(jù)顯示，在HG與NG條件下，HRECs 的小管總主干長度值較低（圖4 B），與ASCs共培養(yǎng)時(shí)也是如此，相反，與pmASCs共培養(yǎng)的HRECs測量到更高的值。在HG與NG條件下，對(duì)于總分離分支長度（圖4 C）呈相反趨勢(shì)，HRECs和 HRECs + ASCs 產(chǎn)生更高的值，而HRECs + pmASCs的值明顯較低。圖4 D所示的分支點(diǎn)測量值與主干和分離分支長度值非常吻合。添加葡萄糖后，HRECs和HRECs + ASCs共培養(yǎng)中的分支點(diǎn)數(shù)較低，HRECs + pmASCs的共培養(yǎng)中分支點(diǎn)數(shù)較高。正如預(yù)期的那樣，分支點(diǎn)的數(shù)量隨著總主干長度值的增加而成比例增加，并且與總分離分支長度成反比。這可能表明，同樣在高葡萄糖條件下，周細(xì)胞樣ASCs的存在會(huì)誘導(dǎo)更有組織的血管網(wǎng)絡(luò)。

圖4    高葡萄糖對(duì)人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（HREC）或與ASCs（HREC + ASC）或pmASCs（HREC + pmASC）共培養(yǎng)的管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。（A）代表性顯微照片顯示了每個(gè)樣本的基質(zhì)膠中的3D培養(yǎng)物。底部的直方圖顯示total master segment length “總主干長度"（B）、total isolated branch length“總分離分支長度"（C）和branching points “分支點(diǎn)"（D）。

總之，這項(xiàng)工作獲得的結(jié)果令人鼓舞，因?yàn)榧词乖诟咂咸烟菨舛却嬖诘那闆r下，周細(xì)胞樣ASCs也具有顯著的活力，高增殖率和顯著的遷移能力。此外，觀察到ROS，促炎細(xì)胞因子和促血管生成因子的產(chǎn)生減少，以及抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加。最后，對(duì)HREC管狀形成結(jié)果觀察到了積極的影響，這些表明，特定的上游處理有助于優(yōu)化基于干細(xì)胞的治療應(yīng)用。當(dāng)這些周細(xì)胞樣ASCs植入體內(nèi)時(shí)，這些在體外獲得的結(jié)果是否真的提供了有益的效果，還有待驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：Mannino G, Longo A, Gennuso F, Anfuso CD, Lupo G, Giurdanella G, Giuffrida R, Lo Furno D. Effects of High Glucose Concentration on Pericyte-Like Differentiated Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2021 Apr 27;22(9):4604. doi: 10.3390/ijms22094604. PMID: 33925714; PMCID: PMC8125146.

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