機械負荷通過調(diào)節(jié)骨重塑在維持骨穩(wěn)態(tài)中起重要作用。骨細胞是嵌入礦化骨基質中zui豐富的細胞類型，是控制骨重塑以響應機械力的主要機械傳感器。骨細胞機械傳感特性導致不同類型的受體和不同的細胞內(nèi)信號通路的激活。骨細胞也是核因子κB配體受體激活子（RANK-L）的主要來源，并且可以通過下調(diào)RANK-L與骨保護素的比例來負調(diào)節(jié)破骨細胞分化以響應機械負荷。

YES相關蛋白（YAP）和具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子（TAZ）首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，被認為是發(fā)育過程中器官生長的主要調(diào)節(jié)因子。YAP/TAZ受到機械和細胞骨架信號的調(diào)節(jié)，并作為機械轉換器控制細胞命運，以響應細胞微環(huán)境的特性。YAP/TAZ與不同的成骨細胞發(fā)生信號通路相互作用，如轉化生長因子β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白通路和Wnt/β-catenin信號通路。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，YAP/TAZ在成骨細胞生成過程中的機械敏感性中起作用。以往研究還在骨細胞系MLO-Y4中證明，Piezo 介導機械轉導并誘導YAP / TAZ核易位以響應剪切應力。

鑒于這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)提出了YAP/TAZ在骨細胞中的潛在作用的問題，特別是在響應3D機械負荷時。因此，在法國巴黎拉里布瓦西埃醫(yī)院、巴黎大學健康學院及英國曼徹斯特曼徹斯特大學生物科學學院聯(lián)合研究的一項實驗中利用了一種新的承受壓縮應力的3D培養(yǎng)模型來表征骨細胞樣細胞系MLO-Y4在機械負荷下的反應。相關內(nèi)容發(fā)表在 Laboratory Investigation 期刊題為“Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line"。

首先，為了確定骨細胞樣細胞系響應機械負荷的最佳條件，實驗對MLO-Y4細胞使用了循環(huán)機械2D拉伸和3D壓縮。將循環(huán)或靜態(tài)拉伸應用于2D細胞培養(yǎng)模型，拉伸百分比、頻率、信號形式和拉伸持續(xù)時間是可調(diào)的，MLO-Y4培養(yǎng)物以0.3 Hz的正弦波形和3%伸長率進行接受9小時的等雙軸動態(tài)拉伸。此外，在體外壓縮裝置將3D MLO-Y4培養(yǎng)物置于0-40 kPa的循環(huán)壓縮下，以1 Hz的正弦波形持續(xù)9小時。與2D拉伸和卸載機械條件相比，3D培養(yǎng)壓縮激活了某些機械敏感基因，例如E11和COX2編碼Ptgs2（圖1 A）。因此，后續(xù)實驗選擇了3D骨細胞壓縮模型。

骨細胞樣細胞系MLO-Y4機械負荷導致YAP/TAZ通路的激活，如靶基因Ankdr1和Tead4的表達增加所示（圖1 B），免疫熒光進一步證實了YAP/TAZ信號的激活，并量化了核易位，這在機械負荷下增加（圖1 C）。3D壓縮不僅降低了Yap表達，而且增加了Taz表達（圖1 D）。此外，3D壓縮增強了YAP/TAZ的蛋白表達，從而表明YAP/TAZ蛋白的穩(wěn)定（圖1 E）。為了確認體內(nèi)骨細胞YAP / TAZ的表達，在6月齡的小鼠股骨中進行抗體標記，在皮質骨和小梁骨中均發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ染色。

圖1     YAP/TAZ活化和核易位的分析。

（A）通過實時 qPCR 評估的 E11/gp38 和 Ptsg2（編碼 COX-2）基因表達，以響應 2D（拉伸）或 3D 培養(yǎng)（壓縮）中的機械負荷。（B）機械加載后通過實時qPCR評估的 YAP/TAZ 靶基因表達。（C）免疫熒光測量的 YAP/TAZ 核易位YAP/TAZ（綠色）和細胞核（DAPI，藍色）的圖像。（D）通過實時qPCR 檢測機械負荷對YAP1和WWTR1 （TAZ）基因表達的影響。（E）MLO-Y4中YAP和TAZ的免疫印跡在3D培養(yǎng)中進行機械加載。

接下來，通過RNAseq確定由作為骨細胞機械傳感過程一部分的YAP/TAZ調(diào)節(jié)的生物過程。首先篩選Yap/Taz shRNA敲低的細胞，基于Yap和Taz shRNA的沉默足以降低YAP/TAZ mRNA和蛋白質水平。

RNAseq分析證明，無論YAP/TAZ敲低如何，負荷成分占方差的大部分，這表明負荷因子的影響很大（圖2 A）。圖2 B-D顯示了MA 圖，即對數(shù)平均值（A值）與log2倍變化（M值）的對比圖。在對照細胞中，Cxcl2是機械負荷誘導的上調(diào)幅度最大的基因（圖2 B）。與YAP/TAZ缺失相比，3D負荷誘導了更多的富集基因（圖2 B），從而避免了由這些轉錄共激活因子沉默引發(fā)的離散基因譜。在機械負荷下，YAP或TAZ缺失的基因反應反應有一定的相似性，表明存在一定程度的富集。Fbn2是機械負荷下骨細胞中YAP和TAZ個體缺失下上調(diào)的基因之一。此外，YAP和TAZ的沉默是有效的，因為這兩種轉錄輔助因子都是下調(diào)最多的基因之一（圖2 C、D）。

圖2   主成分分析和MA（比率強度）圖。

（A）機械負荷（主成分1 ，PC1）和 YAP/TAZ 沉默（主成分2 ，PC2）的主成分分析 （PCA）。（B-D）散點圖描述了兩個條件之間變化的分布（在y軸上：（B）shControl 卸載與 shControl 負載；（C）shControl 負載與shYAP 負載；（D）shControl 負載與 shTAZ 負載）。下調(diào)和上調(diào)基因分別以紅色和綠色表示。

此外，GO分析用于鑒定骨細胞樣細胞系MLO-Y4中機械負荷下由YAP/TAZ調(diào)節(jié)的生物過程。結果表明，TEAD1和TEAD2是通過YAP響應機械負荷而調(diào)節(jié)的主要基因之一，因為YAP的缺失突出了導致這些GO terms 的基因的改變。細胞加載后，與樹突形態(tài)發(fā)生相關的幾個GO terms 被突出顯示，從而提示YAP和TAZ在骨細胞功能與腔隙-小管系統(tǒng)之間的關系中所起的作用。

最后，由于Cxcl2是機械負荷后MLO-Y4骨細胞中上調(diào)最多的基因，因此RNAseq分析的一部分重點關注機械負荷對趨化因子表達的影響。機械應變誘導對照細胞（shRNA對照）中Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平大幅增加。然而，YAP和TAZ的缺失消除了Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平的升高。為了確認在YAP/TAZ調(diào)節(jié)方面與趨化因子表達相關的RNAseq結果，實驗使用了實時qPCR分析，觀察到機械負荷確實增加了對照細胞中Csf1（M-CSF）、Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10的水平（圖3）。沉默 YAP/TAZ 部分減弱了機械負荷后 Csf1 和 Cxcl3 的上調(diào)。相比之下，響應機械負荷上調(diào)的Cxcl10和Cxcl9表達不依賴于YAP/TAZ。這說明YAP/TAZ介導MLO-Y4骨細胞樣細胞系機械誘導的趨化因子表達。

圖3   通過RT-qPCR評估機械負荷后YAP/TAZ敲低對趨化因子表達的影響。

通過實時qPCR檢測YAP/TAZ缺失的MLO-Y4細胞中CSF-1 (M-CSF)、CXCL3、CXCL9和CXCL10 mRNA的表達。

在這項研究中，利用MLO-Y4細胞開發(fā)了一種創(chuàng)新的3D骨細胞樣細胞系培養(yǎng)壓縮系統(tǒng)，以探索機械負荷誘導的基因修飾，并確定YAP/TAZ信號是否在細胞中起機械敏感介質的作用。該實驗模型能夠在由I型膠原組成的3D培養(yǎng)中研究骨細胞的機械轉導，從而代表了一個更生理相關的環(huán)境，還允許應用機械壓縮水平，概括作用在骨骼上的不同力，例如張力、流體剪切力和壓縮力。

總之，該研究結果提供了第一個證據(jù)，證明YAP/TAZ在3D機械刺激后在骨細胞樣細胞中被激活并調(diào)節(jié)趨化因子表達。研究結果表明，YAP/TAZ代表骨細胞樣細胞中機械轉導的調(diào)節(jié)因子，還證明了，骨細胞MLO-Y4細胞是不同趨化因子的主要來源，特別是Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10，這些趨化因子是在機械負荷下釋放的。

參考文獻：Zarka M, Etienne F, Bourmaud M, Szondi D, Schwartz JM, Kampmann K, Helary C, Rannou F, Ha? E, Cohen-Solal M. Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line. Lab Invest. 2021 Dec;101(12):1597-1604. doi: 10.1038/s41374-021-00668-5. Epub 2021 Sep 14. PMID: 34521992.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34521992/

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