Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells

Keywords: cyclic stretch; mechanobiology; metabolomics (LC-MS); osteosarcoma; oxidative stress response.

人體不斷受到物理力的影響，這些力會(huì)改變決定細(xì)胞行為的分子特性。在實(shí)體瘤進(jìn)展過程中，細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷維持遷移的機(jī)械和代謝變化。然而，關(guān)于細(xì)胞的代謝狀態(tài)如何影響其惡性特征，反之亦然，目前知之甚少。

骨肉瘤（OS）是zuipubian的原發(fā)性骨腫瘤。OS細(xì)胞的機(jī)制生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，它們響應(yīng)于幾種細(xì)胞外力學(xué)刺激的變化來調(diào)節(jié)其惡性腫瘤。研究已經(jīng)確定了細(xì)胞外信號(hào)與化療失敗之間的密切聯(lián)系，設(shè)想了細(xì)胞外刺激可以調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性的可能。骨微環(huán)境已被證明在OS的發(fā)生、進(jìn)展和復(fù)發(fā)中起著至關(guān)重要的作用。鑒于已知大多數(shù)化療藥物會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的濃度，并可能破壞癌細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，因此，機(jī)械力有助于細(xì)胞中的細(xì)胞毒性過程是一個(gè)合理的假設(shè)。通常，大多數(shù)癌細(xì)胞中發(fā)生的代謝改變被認(rèn)為有助于腫瘤發(fā)展，并介導(dǎo)對(duì)化療藥物的耐藥性，尤其是，OS中細(xì)胞代謝的改變，這已經(jīng)被報(bào)道與OS惡性腫瘤的等級(jí)相關(guān)。

基于此，意大利圖西亞大學(xué)生態(tài)與生物科學(xué)系和羅馬第二大學(xué)臨床科學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)系的課題團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)研究中利用一種機(jī)械方案（24 h，1 Hz，0.5% 伸長率的循環(huán)拉伸），通過使用非靶向質(zhì)譜方法確定SAOS-2 細(xì)胞中機(jī)械力誘導(dǎo)的代謝改變。由于幾種機(jī)械刺激被報(bào)道通過多種機(jī)制增加自由基（如活性氧和氮）的產(chǎn)生，代謝組學(xué)分析也集中在氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的機(jī)械調(diào)節(jié)上。此外，對(duì)參與氧化應(yīng)激防御的一些機(jī)械敏感的細(xì)胞保護(hù)基因如SOD1，SIRT1，FOXO1和Nrf2的表達(dá)水平進(jìn)行了比較分析，并確認(rèn)了機(jī)械誘導(dǎo)的代謝變化是否有助于骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素誘導(dǎo)的死亡變得更加敏感。研究成果發(fā)表在 Frontiers in Molecular Biosciences 期刊題為“Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells"。

將人骨肉瘤 SAOS-2 細(xì)胞暴露于特定的中等幅度單軸循環(huán)拉伸應(yīng)變方案（1 Hz，0.5%，24h），進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析以評(píng)估由這種機(jī)械刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝變化?；鹕綀D分析表明，與未刺激的 SAOS-2 細(xì)胞（Ctrl對(duì)照）相比，機(jī)械拉伸細(xì)胞中有 48 種代謝物顯著下調(diào)，25 種代謝物顯著上調(diào)，主要表現(xiàn)為甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸等氨基酸的變化。氨基酸水平的增加表明其在循環(huán)拉伸細(xì)胞的能量產(chǎn)生和核苷酸合成中起著核心作用。

為了詳細(xì)研究單軸循環(huán)拉伸對(duì)能量代謝的機(jī)械調(diào)控，比較了暴露于或未暴露于0.5%伸長率單軸循環(huán)拉伸24 h的SAOS-2細(xì)胞的糖酵解（EMP）、戊糖磷酸途徑（PPP）和三羧酸循環(huán)（TCA）。結(jié)果觀察到，機(jī)械拉伸細(xì)胞中葡萄糖-6-磷酸（G6P）豐度的增加（圖1），乳酸積累顯著減少，證實(shí)了循環(huán)拉伸應(yīng)用可以逆轉(zhuǎn) SAOS-2 細(xì)胞中的 Warburg 效應(yīng)（指癌細(xì)胞代謝優(yōu)先采用糖酵解代謝而不是氧化磷酸化代謝以生成能量）。由于PPP和EMP 在代謝上有關(guān)聯(lián)，共享共同的中間產(chǎn)物G6P，糖酵解的增加同時(shí)導(dǎo)致PPP速率降低，反之亦然。正如預(yù)期的那樣，這強(qiáng)調(diào)了 1 Hz 刺激的細(xì)胞中葡萄糖從EMP 轉(zhuǎn)移到 PPP 中。

                   圖1 與對(duì)照（Ctrl）相比，機(jī)械刺激（1 Hz）樣本中屬于糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間體積累的變化。

與未處理的細(xì)胞相比，拉伸刺激的 SAOS-2 細(xì)胞中，在一些單個(gè)氨基酸濃度水平及其相關(guān)途徑的水平上也檢測到顯著差異，如谷胱甘肽代謝的下調(diào)。轉(zhuǎn)硫途徑對(duì)谷胱甘肽的產(chǎn)生有顯著貢獻(xiàn)，它涉及將源自蛋氨酸和葉酸循環(huán)產(chǎn)生的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，再通過一系列途徑生成谷胱甘肽。有趣的是，研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，拉伸細(xì)胞中與蛋氨酸循環(huán)有關(guān)的代謝物下調(diào)（圖2）。

除上述氨基酸外，絲氨酸和甘氨酸也是這些代謝所必需的。絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸的過程涉及維生素B6 作為必需輔酶。這些途徑分別對(duì)核苷酸合成和甲基供體 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的生成很重要。因此，觀察到的機(jī)械誘導(dǎo)的絲氨酸、甘氨酸和維生素 B6 的生物活性形式的上調(diào)，使研究人員能夠假設(shè)這些代謝物不會(huì)通過葉酸循環(huán)供給蛋氨酸循環(huán)。相對(duì)于靜態(tài)組，拉伸刺激細(xì)胞中 SAM 和 S-腺苷同型半胱氨酸水平的降低也證實(shí)了這一假設(shè)，因此它們不參與核苷酸合成和 GSH 的產(chǎn)生。

                            圖2 機(jī)械誘導(dǎo)的氨基酸和維生素B6代謝的中間體積累的變化。

由于代謝組學(xué)分析顯示了機(jī)械處理的 SAOS-2 細(xì)胞中氧化應(yīng)激增加的幾個(gè)顯著特征，因此，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 24 h+1 Hz 機(jī)械刺激是否伴隨著細(xì)胞間 ROS 的產(chǎn)生。與靜態(tài)對(duì)照相比，機(jī)械刺激誘導(dǎo)了1.89倍的ROS 過量生成（圖3 A）。為了評(píng)估機(jī)械和化學(xué)刺激對(duì) ROS 生成的協(xié)同作用，將拉伸預(yù)處理的細(xì)胞與 ROS 誘導(dǎo)劑阿霉素（一種目前用于骨肉瘤治療的化療藥物）一起孵育。同時(shí)進(jìn)行的機(jī)械和化學(xué)刺激顯示，ROS的生成增加；8.6 μM阿霉素處理SAOS-2-細(xì)胞24小時(shí)后ROS生成增加5倍（圖3 A）。因此，化學(xué)誘導(dǎo)的ROS生成掩蓋了SAOS-2細(xì)胞中靜態(tài)和拉伸誘導(dǎo)的ROS生成調(diào)節(jié)之間的差異。

基于取得的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)還假設(shè)拉伸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的破壞可能導(dǎo)致機(jī)械預(yù)處理的 SAOS-2 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒性致敏。因此，采用阿霉素來測試骨肉瘤細(xì)胞對(duì)死亡的抵抗力，用1.25-10 μM范圍內(nèi)不同濃度的阿霉素處理預(yù)拉伸和對(duì)照細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種情況下，SAOS-2 細(xì)胞都以劑量依賴性方式死亡（圖3 B），然而，預(yù)拉伸細(xì)胞的死亡率更高。這表明，1 Hz+24 h拉伸處理可使骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的死亡更敏感。

由于 SOD1、SIRT1、Nrf2 和 FOXO-1 是機(jī)械敏感基因，在對(duì)抗氧化應(yīng)激中起重要作用，因此使用實(shí)時(shí) PCR 測量了其基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，24 h+1 Hz 機(jī)械刺激沒有顯著干擾 FOXO1 的表達(dá)水平，但誘導(dǎo)了 SOD1 基因的上調(diào)，并同時(shí)下調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子基因 SIRT1 和 Nrf2表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，1 Hz 拉伸處理增加了細(xì)胞ROS生成和SAOS-2細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。

                          圖3 機(jī)械誘導(dǎo)的SAOS-2細(xì)胞系活性氧和細(xì)胞毒性的上調(diào)。

圖4 SAOS-2 細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)變化的示意圖：上圖。細(xì)胞形態(tài)：整個(gè)細(xì)胞在循環(huán)拉伸應(yīng)變后伸長率增加，導(dǎo)致 SAOS-2 細(xì)胞的大小顯著增加，細(xì)胞核質(zhì)比（N/C）破壞。下圖：基因表達(dá)水平：雖然成骨分化標(biāo)志物（即 ALP、COL1、RUNX-2）的表達(dá)水平不受機(jī)械刺激的影響，但目前數(shù)據(jù)顯示與未刺激的細(xì)胞相比，機(jī)械刺激的細(xì)胞中 SIRT1 和 Nrf2 下調(diào)，SOD1 上調(diào)。代謝狀態(tài)：機(jī)械刺激與Warburg效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)、谷氨酰胺代謝的上調(diào)、GSH耗竭、細(xì)胞內(nèi)ROS積累和PPP的上調(diào)有關(guān)，同時(shí)與核苷酸合成的下調(diào)有關(guān)。

總之，目前基于LC-MS的代謝組學(xué)分析顯示，在機(jī)械1 Hz刺激后，SAOS-2細(xì)胞中的代謝物發(fā)生了不同的顯著改變。通路分析表明，機(jī)械刺激細(xì)胞的能量代謝被破壞，其特征是糖酵解和三羧酸循環(huán)顯著下調(diào)，但氨基酸代謝也失調(diào)（即谷氨酰胺分解增強(qiáng)，蛋氨酸循環(huán)減少）。反過來，在機(jī)械誘導(dǎo)的 GSH 耗竭和 ROS 富集的支持下，研究數(shù)據(jù)表明，機(jī)械拉伸處理可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)水平的增加，從而使 SAOS-2 細(xì)胞對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感。這些發(fā)現(xiàn)有助于細(xì)致地了解SAOS-2細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的復(fù)雜反應(yīng)，為細(xì)胞行為、轉(zhuǎn)移和對(duì)治療藥物敏感性的潛在影響提供了有價(jià)值的見解。

參考文獻(xiàn)：Fanelli G, Alloisio G, Lelli V, Marini S, Rinalducci S, Gioia M. Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells. Front Mol Biosci. 2024 Apr 25;10:1297826. doi: 10.3389/fmolb.2023.1297826. PMID: 38726050; PMCID: PMC11079223.

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