Inhibition of chemically and mechanically activated Piezo1 channels as a mechanism for ameliorating atherosclerosis with salvianolic acid B

Keywords: Piezo1 channels; atherosclerosis; inhibitor; salvianolic acid B.

丹參酸B（SalB）是一種有機(jī)化合物，是中藥丹參中含量zuifengfu的水溶性物質(zhì)。SalB已被廣泛用于治療心血管疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化。越來越多的證據(jù)表明，SalB的心肌保護(hù)作用歸因于其抑制級聯(lián)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，這些分子轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)多種血管細(xì)胞類型和組織中的內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激、血小板聚集、凝血、血栓形成和炎癥。然而，SalB在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化方面的分子靶點(diǎn)仍然難以捉摸。

響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷刺激而激活的Piezo1離子通道參與廣泛的生理和病理過程。它們在血管機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能包括感知血流的剪切應(yīng)力，促進(jìn)血管發(fā)育，介導(dǎo)血流依賴性血管舒張并防止動(dòng)脈粥樣硬化，以及調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的血管收縮，內(nèi)皮細(xì)胞通透性等。鑒于Piezo1通道在血管生物學(xué)中bukehuoque的作用，它有可能作為一種新的藥物靶點(diǎn)。

在廣州中醫(yī)藥大學(xué)diyi附屬醫(yī)院及山東中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，通過利用Yoda1，一種高選擇性和youxiao的Piezo1通道激動(dòng)劑作為關(guān)鍵工具，證明了SalB對Piezo1通道的抑制作用。研究結(jié)果有助于理解SalB預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化病變的機(jī)制，及其對開發(fā)拮抗Piezo1通道具有藥理作用的低分子量（LWM）藥物的影響。具體研究成果發(fā)表在British Journal of Pharmacology期刊題為“Inhibition of chemically and mechanically activated Piezo1 channels as a mechanism for ameliorating atherosclerosis with salvianolic acid B"。

首先，利用Piezo1通道抑制劑檢測對HUVECs中Yoda1誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在篩選的105種化合物中，SalB顯著抑制Yoda1誘導(dǎo)的Ca2+進(jìn)入HUVECs。當(dāng)細(xì)胞用SalB預(yù)處理30分鐘或直接使用SalB時(shí)，觀察到基線Ca2+測定沒有差異，且SalB抑制Yoda1誘導(dǎo)的Ca2+以濃度依賴性方式進(jìn)入。這表明，SalB是內(nèi)源性Yoda1刺激的Piezo1通道的抑制劑，且SalB對Piezo1通道顯示出一定的選擇性。研究人員還探討了SalB是否可以抑制過表達(dá)外源性Piezo1通道的細(xì)胞中的鈣反應(yīng)，數(shù)據(jù)表明，SalB在過表達(dá)野生型Piezo1的人胚腎細(xì)胞HEK 293T中抑制Yoda1誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流。

此外，實(shí)驗(yàn)還驗(yàn)證了SalB是否可能對天然細(xì)胞具有相同的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SalB抑制了對小鼠肝臟內(nèi)皮細(xì)胞MLECs中Yoda1的反應(yīng)。然而，Yoda1誘發(fā)的Ca2+信號在MLECs中相對低于HUVECs。這些數(shù)據(jù)表明，SalB抑制了MLECs中Yoda1誘導(dǎo)的Piezo1通道的活性。

為了探索SalB是否可以抑制HUVECs中Yoda1介導(dǎo)和機(jī)械感應(yīng)的電流，進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。觀察到基礎(chǔ)電流，然后是響應(yīng)Yoda1的附加電流，之后電流被SalB抑制，但不被DMSO抑制（圖1 a-h）。隨著機(jī)械刺激水平的增加，誘發(fā)電流也相應(yīng)增加（圖1 i）。然而，用10μM SalB預(yù)處理細(xì)胞30分鐘后，這些電流被抑制（圖1 j）。由機(jī)械刺激誘發(fā)并由SalB抑制的電流的電流-壓力關(guān)系（I-μm）表現(xiàn)出正相關(guān)（圖1 k、l）。這些數(shù)據(jù)表明，SalB不僅抑制Yoda1激活，還抑制機(jī)械誘導(dǎo)的Piezo1電流和其他拉伸激活通道。

圖1    SalB抑制激活Piezo1通道產(chǎn)生的電流。

接下來，為了研究SalB在血管生物學(xué)中的生理相關(guān)性，對從小鼠中分離的胸主動(dòng)脈進(jìn)行等距張力記錄，發(fā)現(xiàn)SalB抑制Yoda1引起的胸主動(dòng)脈擴(kuò)張，抑制苯腎上腺素引起的胸主動(dòng)脈收縮，這依賴于Piezo1通道。

鑒于Piezo1通道在感知剪切應(yīng)力方面的作用，因此，實(shí)驗(yàn)探索了SalB對剪切應(yīng)力激活的Piezo1通道的功能影響。當(dāng)將HUVECs暴露于單向?qū)恿鳎?/span>15?dynes·cm2）24小時(shí)后，使用DMSO或10μM SalB，觀察到DMSO細(xì)胞朝向剪切應(yīng)力方向排列，而SalB處理的細(xì)胞則相反。這些數(shù)據(jù)表明，SalB抑制內(nèi)皮細(xì)胞朝機(jī)械應(yīng)力方向排列。

為了確定SalB是否通過Piezo1通道抑制內(nèi)皮細(xì)胞排列，用干擾對照siRNA或Piezo1 siRNA轉(zhuǎn)染的HUVECs暴露于DMSO或10μM SalB的定向剪切應(yīng)力（15?dynes·cm2）下24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)Piezo1 siRNA抑制細(xì)胞排列。因此，在剪切應(yīng)激下，與單獨(dú)使用Piezo1 siRNA細(xì)胞相比，SalB處理的Piezo1 siRNA細(xì)胞中沒有額外的SalB對細(xì)胞排列的效應(yīng)，結(jié)果進(jìn)一步支持了Piezo1通道在SalB抑制細(xì)胞排列的作用中發(fā)揮影響。

為了研究SalB抑制Yoda1誘導(dǎo)的Piezo1通道激活的潛在機(jī)制，檢驗(yàn)了SalB和Yoda1之間存在競爭關(guān)系的假設(shè)。10μM SalB對不同濃度的Yoda1（1、5、10、20、30μM）的抑制作用顯示出濃度相關(guān)性（圖2 a、b）。重要的是，SalB的抑制是可逆的（圖2 c-f）。因此，Yoda1的濃度可能與SalB的抑制率呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，SalB和Yoda1可能對Piezo1通道產(chǎn)生競爭效應(yīng)。

圖2     SalB可能與Yoda1競爭Piezo1通道，這些影響是可逆的。

巨噬細(xì)胞衍生泡沫細(xì)胞的形成是動(dòng)脈粥樣硬化的重要特征。因此，實(shí)驗(yàn)測試了SalB對泡沫細(xì)胞形成的影響。與單獨(dú)用氧化低密度脂蛋白（OxLDL）處理的BMDMs相比，用oxLDL和Yoda1處理的BMDMs的油紅O染色顯著增加。有趣的是，SalB以劑量依賴性方式抑制oxLDL與Yoda1誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成。結(jié)果表明，Yoda1促進(jìn)用oxLDL處理的BMDMs中的泡沫細(xì)胞形成，而SalB抑制泡沫細(xì)胞的形成，且SalB對泡沫細(xì)胞形成的抑制取決于Piezo1通道。

zuihou，為了探究SalB是否抑制體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，研究人員給Ldlr?/?小鼠喂食HFD，并在腹腔注射兩種不同劑量的SalB（SalB-L，30 mg·kg/1天；SalB-H，100 mg·kg/1天）。與正常飲食的小鼠相比，HFD小鼠出現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，特別是在主動(dòng)脈弓（圖3 a、b）。然而，與HFD小鼠相比，接受SalB干預(yù)的HFD小鼠的主動(dòng)脈斑塊顯著減少，且SalB以劑量依賴性方式抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展（圖3 a、b）。

為了進(jìn)一步研究主動(dòng)脈斑塊中脂質(zhì)斑塊的含量，對小鼠主動(dòng)脈根部用油紅O和HE染色。與正常飲食的小鼠相比，HFD的小鼠油紅O染色增加，這與動(dòng)脈脂質(zhì)含量的增加相對應(yīng)。同樣，HE染色結(jié)果顯示動(dòng)脈壁增厚。然而，與HFD組相比，SalB處理顯著降低了脂質(zhì)含量并降低了動(dòng)脈壁的厚度（圖3c-e）。這些數(shù)據(jù)表明，SalB可youxiao抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

然后探討了Piezo1通道是否參與了SalB對動(dòng)脈粥樣硬化的這些抑制作用，利用特異性Piezo1敲除小鼠（Piezo1^?LysM/Ldlr^?/?），發(fā)現(xiàn)Piezo1^?LysM/Ldlr^?/? 小鼠的主動(dòng)脈斑塊顯著減少，且SalB對Piezo1^?LysM/Ldlr^?/?小鼠的主動(dòng)脈斑塊沒有進(jìn)一步的影響（圖3f、g）。這些數(shù)據(jù)表明，SalB對小鼠主動(dòng)脈斑塊的抑制作用取決于Piezo1通道的存在。

圖3    SalB抑制Ldlr?/?和Piezo1?LysM/Ldlr?/?小鼠高脂肪飲食引起的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

綜上所述，該研究表明，SalB通過Yoda1誘導(dǎo)的Piezo1通道youxiao地拮抗離子通量，并通過機(jī)械刺激誘導(dǎo)的這些通道抑制陽離子電流。基于SalB對Piezo1通道的調(diào)節(jié)機(jī)制，可能會(huì)開發(fā)出相關(guān)藥物。然而，關(guān)于SalB對Piezo1通道的藥理學(xué)和調(diào)節(jié)作用，還有很多機(jī)制需要了解。目前的研究為這些離子通道以及SalB在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化病變中的作用機(jī)制提供了新的見解。

參考文獻(xiàn)：Pan X, Wan R, Wang Y, Liu S, He Y, Deng B, Luo S, Chen Y, Wen L, Hong T, Xu H, Bian Y, Xia M, Li J. Inhibition of chemically and mechanically activated Piezo1 channels as a mechanism for ameliorating atherosclerosis with salvianolic acid B. Br J Pharmacol. 2022 Jul;179(14):3778-3814. doi: 10.1111/bph.15826. Epub 2022 Mar 19. PMID: 35194776.

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