CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression

Subject terms: Orthodontics, Cell signalling

正畸治療是通過(guò)正畸牙齒移動(dòng)（OTM）矯正咬合不正。OTM 是一種基于壓力-張力理論的機(jī)械生物學(xué)過(guò)程。壓力側(cè)的骨吸收是限速步驟，破骨細(xì)胞活化在骨代謝中起決定性作用。破骨細(xì)胞來(lái)源于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞造血前體細(xì)胞，最終分化為成熟的破骨細(xì)胞。在正畸力刺激下，牙周成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞釋放出一系列細(xì)胞因子，間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化。

研究表明，機(jī)械刺激可以通過(guò)機(jī)械敏感受體（包括機(jī)械敏感離子通道和細(xì)胞粘附分子）直接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化。G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是位于細(xì)胞膜表面的受體大家族，與破骨細(xì)胞分化和成熟密切相關(guān)。GPCRs 可以感知機(jī)械力并參與細(xì)胞內(nèi)生物過(guò)程。然而，GPCRs 是否通過(guò)感應(yīng)機(jī)械力參與破骨細(xì)胞生成仍是未知數(shù)。

CD97，也被稱為ADGRE5，是一種粘附類(lèi)G 蛋白偶聯(lián)受體（aGPCR），這種分子在免疫系統(tǒng)疾病和上皮細(xì)胞衍生的惡性腫瘤中的作用已被充分證明，但最近，CD97 的機(jī)械感應(yīng)功能引起了越來(lái)越多的關(guān)注。然而，CD97 在牙周組織中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，正畸力是否會(huì)改變 CD97 表達(dá)仍不清楚，CD97 是否調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化或參與 OTM 也尚未闡明。

基于此，河北省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及國(guó)家口腔醫(yī)學(xué)中心（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院）的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)研究中，使用 OTM 和靜態(tài)加壓應(yīng)用模型探索了 CD97 表達(dá)與破骨細(xì)胞分化之間的關(guān)系。CD97 被確定為抑制破骨細(xì)胞分化和 OTM 的潛在機(jī)械感應(yīng)分子。這些發(fā)現(xiàn)將有助于理解 OTM 的機(jī)制，并為加速牙齒移動(dòng)提供潛在的治療靶點(diǎn)。研究成果發(fā)表在  International Journal of Oral Science  期刊題為“CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression"。

首先，分別分析了來(lái)自牙周組織和牙槽骨的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞亞群存在于牙周組織和牙槽骨中，CD97 在兩者的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞簇中高度表達(dá)。

為了研究機(jī)械力對(duì) CD97 表達(dá)的影響，將小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 細(xì)胞暴露于 1 g/cm2 的靜態(tài)壓縮 2 小時(shí)（圖1 a）。Piezo1 的 mRNA 表達(dá)上調(diào)，表明壓縮力施加成功（圖1 b）。與對(duì)照組相比，CD97 mRNA 表達(dá)上調(diào)，而其他成員如 Gpr126、Gpr133 和 Gpr114 的表達(dá)下調(diào)。

此外，還檢測(cè)了 CD97 在不同受力和時(shí)間下的 mRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在 1 g/cm2 和 2 g/cm2 壓縮力刺激2 小時(shí)下以力依賴性方式上調(diào)（圖1 c）。在刺激的早期階段（1、2、4 h），靜態(tài)壓縮應(yīng)用顯著增強(qiáng)了CD97 mRNA的表達(dá)（圖1 d）。通過(guò)活性染色將 1 g/cm2 壓縮力持續(xù)4 小時(shí)確定為最佳壓縮條件。TRAP染色用于觀察和評(píng)估破骨細(xì)胞生成（圖1 e），破骨細(xì)胞的數(shù)量（圖1 f）和 TRAP-陽(yáng)性細(xì)胞面積的百分比（圖1 g）在壓縮負(fù)荷和 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成 7 天后顯著降低。

通過(guò)SEM 評(píng)估破骨細(xì)胞的骨吸收功能（圖1 h），與對(duì)照組相比，吸收陷窩（resorption pit）形成的數(shù)量（圖1 i）和面積（圖1 j）顯著降低。免疫熒光染色證實(shí)，靜態(tài)壓縮后壓縮負(fù)荷上調(diào)了 CD97 表達(dá)（圖1 k、l）。這些數(shù)據(jù)表明，靜態(tài)壓縮上調(diào)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞中 CD97 的表達(dá)并抑制破骨細(xì)胞生成。

圖1    靜態(tài)壓縮上調(diào)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞中 CD97 的表達(dá)并抑制破骨細(xì)胞生成。

接下來(lái)，為了探討 CD97 在正畸壓縮下牙周組織巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)建立了 OTM 模型，與第3天相比，第7天OTM距離顯著增加。通過(guò) TRAP 染色，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的數(shù)量從第 0 天到第 7 天增加。以F4/80分子為巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，檢測(cè)其在小鼠牙周組織中的表達(dá)，CD97+ F4/80+ 巨噬細(xì)胞的免疫熒光共定位顯示，第 3 天牙周組織中陽(yáng)性細(xì)胞增多。CD97+ F4/80+ 巨噬細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，與OTM距離呈負(fù)相關(guān)。這表明，在早期正畸力負(fù)荷期間，CD97 在牙周組織巨噬細(xì)胞中的表達(dá)增加。

為了確定 CD97 在破骨細(xì)胞形成中的功能，特異性敲低 RAW264.7 細(xì)胞中的 Cd97 mRNA。TRAP 染色表明，CD97 的敲低刺激了破骨細(xì)胞的分化（圖2 a、b）。CD97 的缺失促進(jìn)了吸收陷窩的形成（圖2 c、d）。在 CD97 敲低組中，偽足小體肌動(dòng)蛋白環(huán)（Podosome actin Belt-）陽(yáng)性破骨細(xì)胞的大小和數(shù)量增加（圖2 e、f）。此外，CD97 的敲低上調(diào)了與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因的表達(dá)（圖2 g-j）。

為了確定單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞中的 CD97 對(duì)機(jī)械負(fù)荷的感應(yīng)，將RAW264.7 細(xì)胞在 CD97 敲低后暴露于靜態(tài)壓縮，1 g/cm2 的靜態(tài)加壓負(fù)荷4 小時(shí)后抑制破骨細(xì)胞的形成和吸收。敲低 CD97 部分恢復(fù)了在壓縮下的破骨細(xì)胞生成（圖2 a、b）。與此一致，破骨細(xì)胞吸收功能（圖2 c-f）和破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因被恢復(fù)（圖2 g-j）。這些結(jié)果表明，CD97 可能是破骨細(xì)胞分化過(guò)程中重要的機(jī)械敏感受體。

圖2     CD97 介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)。

為了確定 CD97 在壓縮負(fù)荷下抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制，對(duì)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 shRNA（LV-shNC）和 CD97 shRNA（LV-shCD97）的 RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行了 RNA 測(cè)序分析。結(jié)果表明，396 個(gè)基因上調(diào)，176 個(gè)基因下調(diào)。GO分析顯示，上調(diào)的基因集在 ERK1 和 ERK2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)中富集。KEGG分析顯示，在壓縮刺激下，CD97 敲低的 RAW264.7 細(xì)胞中，Rap1 信號(hào)通路受到抑制，Rap1a 的表達(dá)下調(diào)。qRT-PCR 同樣證實(shí)了 CD97 敲低下調(diào)了 Rap1 信號(hào)通路的代表性基因表達(dá)，如 Rap1a、Epac1 和 Adcy6。

由于 Rap1 的活化通過(guò)抑制 ERK 通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中起重要作用，而ERK通路是破骨細(xì)胞分化所必需的，因此檢測(cè)了巨噬細(xì)胞中 Rap1a 和 ERK 的蛋白水平。CD97 敲低下調(diào) Rap1a 水平并上調(diào)磷酸化 ERK 表達(dá)。在壓縮刺激下，CD97 和 Rap1a 蛋白水平升高，磷酸化 ERK 表達(dá)降低。CD97 的敲低部分恢復(fù)了壓縮力下磷酸化的 ERK 表達(dá)。這表明，Rap1a/ERK 信號(hào)通路介導(dǎo) CD97 在壓縮刺激下對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。

最后，為了確定 Rap1a/ERK 信號(hào)是否參與機(jī)械力刺激下的破骨細(xì)胞分化，對(duì)RAW264.7 細(xì)胞施加靜態(tài)壓縮并添加 Rap1a 抑制劑GGTI298。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜態(tài)壓縮抑制破骨細(xì)胞的形成和活性，而GGTI298 恢復(fù)了壓縮下的破骨細(xì)胞的分化和活性（圖3 a-d）。Western blotting 顯示，磷酸化的 ERK 表達(dá)因壓縮而下調(diào)，并且在 GGTI298 處理后被部分逆轉(zhuǎn)（圖3 e）。

然后，實(shí)驗(yàn)在 OTM 期間對(duì)小鼠單側(cè)第一磨牙施用GGTI298，發(fā)現(xiàn)GGTI298注射加速了牙齒移動(dòng)（圖3 f、g），牙周韌帶中的 TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞也增加（圖3 h、i）。 這些結(jié)果表明，機(jī)械力通過(guò) Rap1a/ERK 信號(hào)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和 OTM抑制Rap1a 可以刺激破骨細(xì)胞分化并加速 OTM。

圖3    機(jī)械力通過(guò) Rap1a/ERK 信號(hào)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和正畸牙齒移動(dòng)。

總之，該研究揭示了 CD97 是一種新型機(jī)械敏感的 aGPCR，使巨噬細(xì)胞能夠感知壓縮并將此信息與 Rap1a/ERK 信號(hào)整合以抑制破骨細(xì)胞生成和 OTM（圖3 j）。具體來(lái)說(shuō)，CD97 在牙槽骨和牙周組織的單核巨噬細(xì)胞中表達(dá)。壓縮上調(diào) CD97 表達(dá)并抑制破骨細(xì)胞分化。此外，CD97 介導(dǎo)的機(jī)械感覺(jué)及其下游 Rap1a/ERK 信號(hào)通路對(duì)于調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和阻礙早期牙齒移動(dòng)至關(guān)重要。這種對(duì)壓縮如何影響破骨細(xì)胞分化的理解可能會(huì)對(duì) OTM 中牙周組織的生物反應(yīng)產(chǎn)生新的機(jī)制見(jiàn)解，并最終為正畸治療提供新的策略。

參考文獻(xiàn)：Wang W, Wang Q, Sun S, Zhang P, Li Y, Lin W, Li Q, Zhang X, Ma Z, Lu H. CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression. Int J Oral Sci. 2024 Feb 4;16(1):12. doi: 10.1038/s41368-023-00272-x. PMID: 38311610; PMCID: PMC10838930.

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