如何測人體zui大微生態(tài)庫？下一代測序來幫忙

在人體中zui大的微生態(tài)庫是生活在人體消化道微生物復合群落組成的腸道菌群，別看人體腸道所占體積不大，但是人體腸道內(nèi)寄生著10萬億個細菌，它們能影響體重和消化能力、抵御感染和自體免疫疾病的患病風險，還能控制人體對癌癥治療藥物的反應。

人體腸道的正常微生物，如雙歧桿菌，乳酸桿菌等能合成多種人體生長發(fā)育必須的維生素，如B族維生素（維生素B1、B2、B6、B12），維生素K，煙酸、泛酸等，還能利用蛋白質(zhì)殘渣合成必需氨基酸，如天冬門氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸等，并參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝，同時還能促進鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收。這些營養(yǎng)物質(zhì)對人類的健康有著重要作用，一旦缺少會引起多種疾病。

研究表明慢性疾病，如肥胖癥，炎性腸?。↖BD），糖尿病，代謝綜合征，癥狀性動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪肝疾病，都與腸道菌群密切相關。許多國內(nèi)外的相關研究由此開展，像歐盟的胃腸道元基因組計劃（MetaHIT），該計劃的目標是建立腸道菌群基因與人類健康疾病的關系，像美國2008年推出的人體微生物組計劃（HMP），為期五年，1.15億美元的總預算。這個項目的zui終目標是測試人體菌群變化，以及其與人類健康或疾病的關聯(lián)性。

在中國，國家批準了感染性疾病相關腸道微生物的研究計劃。該項目的目標是利用系統(tǒng)生物學，包括宏基因組學和代謝組學的方法研究感染性疾病的腸道微生物變化。

在這里，特別值得注意的是宏基因組學，宏基因組學（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基因組學、元基因組學，它通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建宏基因組文庫，利用基因組學的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。

也就是說，我們要使用宏基因組學這個方法來研究腸道微生物變化，這個任務是非常艱巨的，至少在下一代測序發(fā)明之前，是不可想象的。

凡是在實驗室使用過一代測序--Sanger法測序的同學都知道，往往為了測一小段DNA，首先要將樣品擴增，全部過程下來，大半天的時間是起步價，如果以這個速度測腸道菌群的宏基因組學所需數(shù)據(jù)，那估計窮極一生，我們也是不肯能完成這個任務的。

工欲善其事，必先利其器，那么下一代測序又是怎樣完成全部測序任務的呢？

下一代測序不需要進行PCR擴增，以Helico BioScience 單分子測序技術(shù)為例，該測序是基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在 3' 末端加上 poly(A)，以及在poly(A)的末端進行熒光標記和阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊 合成邊測序的位點 加入聚合酶和被Cy3熒光標記脫氧核苷酸進行DNA 合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀測模板位點上是否有熒光信號，然后化學裂解核苷酸 上的燃料并釋放 加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進行下一輪反應。

有此利器在手，測腸道菌群的宏基因組當然不在話下。

在前期研究中，浙江大學感染性疾病協(xié)同創(chuàng)新中心研究員秦楠，負責的實驗室通過定量宏基因組技術(shù)對98個肝硬化病人和83個健康人的腸道菌群進行了研究。建立了*個肝硬化參考基因集，包括269萬基因，其中36.1%為新基因；肝硬化患者和健康個體之間基因豐度存在差異，可將它們分為66個代表同源細菌物種的組群，其中28個組群豐富地存在于患者體內(nèi)，38個組群豐富地存在于對照個體中。*次發(fā)現(xiàn)肝硬化患者體內(nèi)存在大量細菌起源于口腔；找到一種由15個基因構(gòu)成的生物標記物，建立了肝硬化菌群失衡診斷的新標準（PDI指數(shù)），并在一個獨立組群中進行了驗證，可作為肝硬化診斷的強有力工具，該研究內(nèi)容于2014年7月在Nature雜志上發(fā)表。

此次生物谷召開的2015 下一代測序發(fā)展論壇：行業(yè)探討與臨床應用，就有幸邀請到了秦楠博士同我們分享下一代測序在臨床應用研究中發(fā)揮的巨大作用。我們熱忱歡迎您的參與，與來自測序行業(yè)的企業(yè)單位，研究機構(gòu)的14位嘉賓共同探討下一代測序的行業(yè)發(fā)展，臨床應用！