細(xì)胞凋亡檢測操作步驟之ELISA法

細(xì)胞凋亡發(fā)生時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶將分解核小體區(qū)間的雙鏈DNA，但核小體本身由于由組蛋白緊密結(jié)合而免受切割，單克隆抗體可以與核小體形成夾心結(jié)構(gòu)，可通過檢測核小體判斷細(xì)胞是否經(jīng)歷凋亡事件。

(一) 原理

細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA,產(chǎn)生180bp～200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，可特異性檢測細(xì)胞溶解物中的核小體片段。

(二)材料與試劑

1.采用Boehringer Mannheim公司試劑盒，生物標(biāo)記的小鼠抗組蛋白單克隆抗

體。

2.過氧化物酶(-POD)標(biāo)記的小鼠抗DNA單克隆抗體

3.鏈霉親合素包被的微孔板

4.DNA-組蛋白復(fù)合物，作為陰性對照。

5.ABTS底物

6.溶解緩沖液

7.溫育緩沖液

8.底物緩沖液

(三)樣品

1.培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物細(xì)胞裂解步驟：收集細(xì)胞，離心后，用200µl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min。

2.培養(yǎng)細(xì)胞的上清液

3.血漿(血清)

(四)操作方法

1.取樣品離心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液，加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中。

2.另加入80µl免疫反應(yīng)試劑含抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物素及溫育緩沖液(按1︰1︰18混合)，室溫下孵育2h(置搖床上，250r/min)。

3.取上清，用300µl溫育緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液。

4.加入100µl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合(置搖床上)。

5.盡快作比色分析(10min～20min內(nèi))，用底物緩沖液作空白對照，以波長405nm，參考波長492nm進(jìn)行檢測。

(五)結(jié)果判定

按下列公式計算細(xì)胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值：

注：mU=吸收值(10-3)=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若樣品的吸收值超過比色測定范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測。