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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號(hào)	XY-0092	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴(kuò)增效率、更高的擴(kuò)增靈敏度、更高的擴(kuò)增特異性。

巴貝斯屬蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Babesia spp.

產(chǎn)品及特點(diǎn)

巴貝斯蟲病，是由巴貝斯蟲引起的人的血液原蟲病，是一種人畜共患病。自 1957 年 Skrabalo 和 Deanovic 在南斯拉夫報(bào)告一個(gè)人體病例以來，截止 1984 年，報(bào)道人的病例已超過 100 例。早期報(bào)道的歐洲病例大多數(shù)是由于其它原因切除了脾臟而引起的，其癥狀較為嚴(yán)重，常為致命性的。因此巴貝斯屬蟲的快速準(zhǔn)確鑒定有著重要作用。本公司開發(fā)巴貝斯屬蟲通用染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 引物根據(jù)巴貝斯屬蟲專一區(qū)設(shè)計(jì)，特異性高。

3. 熒光定量 PCR 檢測(cè)，比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

巴貝斯屬蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號(hào)	成分	規(guī)格
試劑一	2×PCR MagicMix	0.5 mL（棕色）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	巴貝斯屬蟲通用染料法 PCR 引物混合物	100 μL（白蓋）
試劑四	巴貝斯屬蟲通用染料法 PCR 陽性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL)	50 μL（紅蓋）
試劑五	使用手冊(cè)	1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽性對(duì) 照。

2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對(duì)照的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）或第 5 號(hào)（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè) 樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

成分	樣品管 N+2 個(gè)	PCR 陰性對(duì)照管	PCR 陽性對(duì)照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix （棕色管）	10 μL	10 μL	各 10 μL
巴貝斯屬蟲通用染料法 PCR 引物混合液（白蓋）	2 μL	2 μL	各 2 μL
自備 10×ROX (見注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 待測(cè)樣品 cDNA 模板	6 μL
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號(hào)）			各 6μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…）

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

過程	溫度	時(shí)間
預(yù)變性	95℃	5 min
PCR 反應(yīng) （30 個(gè)循環(huán)）	95℃	15 sec
PCR 反應(yīng) （30 個(gè)循環(huán)）	60℃	1 min，（采集 SYBR 通道的熒光信號(hào)）

按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行熔解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 36。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性，如果小于或等于 30 則為陽性。如果在 30-35 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 35，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。