鏈球菌B組染料法熒光定量PCR試劑盒

Group B Streptococcus spp.(GBS)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

鏈球菌B組(Group B Streptococcus spp, GBS)能引起牛乳房炎，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)，因此早期被畜醫(yī)界重視。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，發(fā)現(xiàn)B族鏈球菌還可引起新生兒敗血癥、肺炎、腦膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生兒，還有可能有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括腦積水、智力障礙、小頭畸形、耳聾等。同時(shí)，B族鏈球菌還可引起孕婦感染、引起早產(chǎn)、胎兒發(fā)育不良（低體重兒）、胎膜早破及晚期流產(chǎn)，因此快速檢測(cè)鏈球菌B組具有重要意義。熒光定量PCR是檢測(cè)傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門檢測(cè)鏈球菌B組的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，用戶只需要提供DNA模板。
2.特異性高，引物是根據(jù)人鏈球菌B組高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他細(xì)菌。
3.引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性比常規(guī)PCR高100倍。
4.提供無(wú)傳染性的PCR陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
5.一管式操作，熒光PCR檢測(cè)，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。
6.本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠50次20μL體系的PCR。

鏈球菌B組染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DN段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3.在7號(hào)管中加入5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8.如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析，則6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選4號(hào)，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。
10在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)
五、數(shù)據(jù)處理
12.設(shè)定60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽(yáng)性。
13.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
14.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性