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            技術(shù)文章

            優(yōu)化原位雜交(ISH)的10個小技巧

            閱讀:1438          發(fā)布時間:2018-12-27

            10 Tips for Optimizing In Situ Hybridization (ISH)

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              Enzo Life Sciences在研究試劑盒,生物化學(xué)品和生物制品的制造和供應(yīng)方面擁有40多年的經(jīng)驗。

            作為為科學(xué)家提供支援的科學(xué)家,我們很樂意提供簡單但有用的技巧,以改善您日常任務(wù)以及研究的整體質(zhì)量。

            從這一點(diǎn)出發(fā),以下我們?yōu)槟峁┝嗽谠浑s交中獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)的綜合技巧。

            原位雜交是一種廣泛使用的生物技術(shù),它能為準(zhǔn)確定位分裂中期滴片、細(xì)胞和組織中內(nèi)源性的、細(xì)菌或病毒的核酸(如DNA,mRNA和microRNA)。

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            1.合適的探針

             

              由于雜交可以發(fā)生在互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之間,故DNA或RNA探針(又稱為核糖探針)都可以用于定位給定樣品中的DNA或RNA。然而,RNA-RNA雜交體比RNA-DNA雜交體更穩(wěn)定,而RNA-DNA雜和體又比DNA-DNA雜合體更穩(wěn)定。雙鏈DNA探針易于在實(shí)驗室中進(jìn)行制備、標(biāo)記和使用;而單鏈RNA探針的大小均一,可實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的高度插入,并形成高度穩(wěn)定的RNA-RNA雜交體。而且,單鏈寡核苷酸探針(Oligonucleotides)如今可以通過化學(xué)方法簡單地合成并且加上高比放射性。目前,也可以使用肽骨架或鎖核酸(LNA)作為替代品,以提高雜交效率和穩(wěn)定性。

             

            2.合適的標(biāo)簽

             

              用于組織微陣列的放射性標(biāo)記探針應(yīng)使用35S-NTP,以避免信號溢出。如果實(shí)驗?zāi)康氖鞘古c周圍細(xì)胞或組織結(jié)合的探針可視化(·常見的情況),那么您可以選擇能夠使探針能被直接檢測的一系列熒光染料。又或者,您可以使用如生物素、地·高辛或者色原體等間接標(biāo)記,這類標(biāo)記不易隨著時間變化而發(fā)生信號猝滅,與免疫組織化學(xué)(IHC)類似。

             

            3.正確的標(biāo)記技術(shù)

             

              缺口平移法或隨機(jī)引物標(biāo)記法是產(chǎn)生長的雙鏈DNA探針的方法(推薦使用ENZ-GEN111-0050),而使用含RNA聚合酶啟動子的載體則可用于體外轉(zhuǎn)錄以制備RNA探針。寡核苷酸可以在其合成期間直接標(biāo)記,或者可以使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶或T4多聚核苷酸激酶將標(biāo)記的核苷酸添加至其末端。

             

            4.合適的檢測方法

             

              由于熒光標(biāo)記可以在FISH探針合成期間引入并通過熒光顯微鏡檢測,因此可以進(jìn)行直接檢測。這樣,可以容易地進(jìn)行多重檢測,因為可以在任何時間觀察兩種或更多種不同熒光團(tuán)標(biāo)記的不同探針(推薦ENZO SEEBRIGHTTM系列)。生物素標(biāo)記可以用來自蛋清的親和素或來自細(xì)菌S. avidinii的鏈霉親和素檢測,而地·高辛可以與地·高辛抗體配對。兩種間接標(biāo)記方法終可以用堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)來處理,與特定底物反應(yīng)產(chǎn)生CISH的顯色沉淀,從而達(dá)到可視化的目的。

             

            5.優(yōu)化蛋白酶K的消化

             

              蛋白酶K的消化是ISH成功的關(guān)鍵步驟,因為消化不足將導(dǎo)致雜交信號減弱。另一方面,如果樣品過度消化,組織的形態(tài)將會很差或*被破壞,導(dǎo)致無法定位雜交信號。因此,蛋白酶K的·佳濃度會根據(jù)組織類型、固定長度和組織大小而變化。 通常,在室溫下使用1-5 μg/ mL蛋白酶K處理 10min是開展ISH的一個不錯的起始點(diǎn)。蛋白酶K消化·佳條件的確定應(yīng)以系列不同濃度的蛋白酶K進(jìn)行滴定,然后再與所選擇的探針雜交。產(chǎn)生·高雜交信號且蛋白質(zhì)組織或細(xì)胞形態(tài)被破壞少時的蛋白酶K濃度即為您應(yīng)該選擇的濃度。

             

             

            6.強(qiáng)化雜交條件

             

              強(qiáng)化雜交條件的目的是僅在探針和其靶標(biāo)之間獲得雜交,從而實(shí)現(xiàn)可能的·高特異性。雜交特異性(嚴(yán)格度)主要由探針和靶核酸序列之間的同源性程度、探針濃度、溫度和雜交時間,以及雜交溶液中存在的單價陽離子的濃度所決定。尤其應(yīng)該仔細(xì)地優(yōu)化雜交溫度,通常在55和62°C之間,以獲得高度特異性的結(jié)果。甲酰胺允許雜交在顯著低于探針-靶-雜交體的實(shí)際解鏈溫度的溫度下進(jìn)行,從而有助于保護(hù)樣品的形態(tài)。為了更好地標(biāo)記目的基因,通常會引入COT序列(ENZ-GEN116-0500)以減少與重復(fù)DNA序列的非特異性雜交。

             

            7.優(yōu)化雜交后處理條件

             

              反應(yīng)之后,接下來進(jìn)行的是增加嚴(yán)格度的雜交后洗滌,以出去不*的配對,使靶序列上僅留下特異性結(jié)合的探針。如果您在ISH分析中遇到高背景,您可以用核酸酶消化非特異性結(jié)合的探針來進(jìn)一步降低背景。例如,在進(jìn)行檢測步驟之前,使用S1核酸酶處理DNA探針,使用RNase來處理RNA探針。

             

            8.如果使用DNA探針,修改洗滌步驟

             

              DNA探針有著與RNA探針相同的靈敏度,但DNA探針不能像RNA探針那樣與樣品中的靶分子結(jié)合得那么牢固。 因此,當(dāng)使用DNA探針時,不應(yīng)在雜交后使用甲醛洗滌。

             

            9.優(yōu)化檢測

             

              使用生物素標(biāo)記的探針時,請注意生物素也是在細(xì)胞和組織中產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)。因此,內(nèi)源性的生物素可能導(dǎo)致非特異性染色,因為基于(鏈霉)親和素的檢測系統(tǒng)將與樣品中所有可接觸的生物素分子結(jié)合。在這些情況下,您需要通過在探針雜交之前向樣品中添加過量(鏈霉)親和素來阻斷內(nèi)源性生物素,或者您應(yīng)該使用地·高辛代替生物素來作為探針標(biāo)記。地·高辛是從洋地黃植物中分離的非放射性免疫標(biāo)簽,因此不太可能被除抗地·高辛抗體之外的生物材料檢測到。因此,地·高辛標(biāo)記的使探針檢測有著高親和力、高靈敏度以及重要的特異性。

             

            10.經(jīng)常更換試劑

             

              為了獲得具可重復(fù)性和有效的數(shù)據(jù),應(yīng)每2-3周補(bǔ)充一次三乙醇胺和乙酸酐,每3-4天更換10%中性甲醛溶液(NBF)。

             

            相關(guān)產(chǎn)品

             

            產(chǎn)品編號

            產(chǎn)品名稱

            用途

            包裝

            ENZ-GEN111-0050

            Nick translation DNA labeling system 2.0
            缺口平移法DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0 

            ISH(in situ hybridization)
                FISH

            50 tests

            ENZ-42853

            SEEBRIGHT™ Aqua 431 dUTP
            水綠 431 dUTP

            FISH

            25 nmol

            ENZ-42831

            SEEBRIGHT™   Green 496 dUTP
            綠色 496 dUTP

            FISH

            25 nmol

            ENZ-42843

            SEEBRIGHT™   Gold 525 dUTP
            金色 525 dUTP

            FISH

            25 nmol

            ENZ-42842

            SEEBRIGHT™   Orange 552 dUTP
            橙色 552 dUTP

            FISH

            25 nmol

            ENZ-42844

            SEEBRIGHT™ Red 580 dUTP
            紅色 580 dUTP

            FISH

            25 nmol

            ENZ-42505

            Cyanine 3-UTP (enhanced)
            青色素 3-UTP (增強(qiáng)型) 

            用于標(biāo)記

            250 nmol

            ENZ-42506

            Cyanine 5-UTP (enhanced)
            青色素 5-UTP (增強(qiáng)型)

            用于標(biāo)記

            250 nmol

            ENZ-ACC102-0150

            SAVIEW® PLUS HRP reagent
            即用型HRP溶液

            IHC
                ISH (in situ hybridization)

            150 tests

            ENZ-ACC111-0150

            SAVIEW® PLUS AP Reagent
            SAVIEW® PLUS AP試劑

            IHC
                ISH (in situ hybridization)

            150 tests

            ENZ-NUC113-0025

            Digoxigenin-dUTP, alkali-stable
            地·高辛-dUTP,堿穩(wěn)定 

            用于標(biāo)記

            25 nmol

            ENZ-NUC114-0250

            Digoxigenin-UTP, alkali-stable
            地·高辛-UTP,堿穩(wěn)定

            用于標(biāo)記

            250 nmol

            ENZ-GEN114-6000

            DIGX® HPV type 16/18/31/33/51   probe
            DIGX™ HPV 16/18/31/33/51型探針

            ISH (in situ hybridization)

            6 mL

            ENZ-GEN114-1000

            1 mL

            ENZ-GEN112-6000

            DIGX® HPV type 6/11 probe
            DIGX™ HPV 6/11型探針

            ISH (in situ hybridization)

            6 mL

            ENZ-GEN112-1000

            1 mL

            ENZ-GEN113-6000

            DIGX® HPV type 16/18   probe
            DIGX™ HPV 16/18型探針 

            ISH (in situ hybridization)

            6 mL

            ENZ-GEN113-1000

            1 mL

            ENZ-ABS304-6000

            DIGX® Mouse anti-digoxigenin linker (Ready-to-Use)
            DIGX™ 小鼠抗地·高辛配體

            ISH (in situ hybridization)

            6 mL

            ENZ-ABS303-6000

            DIGX® Rabbit anti-digoxigenin linker (Ready-to-Use)
            DIGX™ 兔抗地·高辛連接體

            ISH (in situ hybridization)

            6 mL

            ENZ-ACC114-0150

            POLYVIEW® PLUS AP (anti-mouse) reagent
            POLYVIEW® PLUS AP(抗老鼠)試劑

            IHC
                ISH (in situ hybridization)

            150 tests

            ENZ-ACC104-0150

            POLYVIEW® PLUS HRP (anti-mouse) reagent
            POLYVIEW® PLUS AP(抗老鼠)試劑

            IHC
                ISH (in situ hybridization)

            150 tests

            ENZ-ACC103-0150

            POLYVIEW® PLUS HRP (anti-rabbit) reagent
            即用型HRP溶液(兔抗)

            IHC
                ISH (in situ hybridization)

            150 tests

            ADI-950-170-0030

            HIGHDEF® yellow IHC chromogen (HRP)
            HighDef 黃色 免疫組化 色原體 (HRP)

            IHC
                ISH (in situ hybridization)

            30 mL

            ADI-950-150-0030

            HIGHDEF® blue IHC chromogen (AP)
            HighDef 藍(lán)色 免疫組化 色原體(AP)

            IHC
                ISH (in situ hybridization)

            30 mL

            ADI-950-171-0030

            HIGHDEF® black IHC chromogen (HRP)
            HighDef 黑色 免疫組化 色原體 (HRP) 

            IHC
                ISH (in situ hybridization)

            30 mL

            ENZ-32885

            PATHO-GENE® HPV type 6/11   probe
            PathoGene 人乳頭瘤病毒 6/11型探針

            HPV探針

            1 mL

            ENZ-32885-6000

            6 mL

            ENZ-32886

            PATHO-GENE® HPV type 16/18   probe
            PathoGene 人乳頭瘤病毒 16/18型 探針

            HPV探針

            1 mL

            ENZ-32886-6000

            6 mL

            ENZ-32887

            PATHO-GENE® HPV type 31/33/51   probe
            PathoGene 人乳頭瘤病毒 31/33/51型 探針 

            HPV探針

            1 mL

            ENZ-32887-6000

            6 mL

            ENZ-32882-6000

            PATHO-GENE® HPV type   16/18/31/33/51 probe
            PathoGene 人乳頭瘤病毒 type 16/18/31/33/51 探針 

            HPV探針

            1 mL

            ENZ-32882-1000

            6 mL

            ENZ-32884

            PATHO-GENE® HPV screening   probe
            PathoGene 人乳頭瘤病毒 篩選探針 

            HPV探針

            1 mL

            ENZ-32884-6000

            6 mL

            ENZ-32895

            PATHO-GENE® AP-NBT/BCIP HPV in situ typing assay
                 (types 6/11, 16/18 and   31/33/51)
                PathoGene Alk phos-NBT/BCIP 人乳頭瘤病毒類型原位檢測(組織)

            ( 6/11, 16/18 和 31/33/51型)

            Colorimetric detection

             10 assays

            ENZ-32879

            PATHO-GENE® AP-NBT/BCIP HPV in situ screening assay
            PathoGene 人乳頭瘤病毒檢測 

            Colorimetric detection

            20 assays

            ENZ-33905-0050

            In situ hybridization buffer

            for HPV probes (Ready-to-Use)
            HPV探針原位雜交緩沖液(即用型) 

            HPV探針用緩沖液

            50 mL

            ENZ-33809

            In situ hybridization wash reagent
            原位雜交洗滌試劑

            原位雜交洗滌試劑

            30 mL

            ENZ-32893-6000

            Mouse anti-biotin linker

            (Ready-to-use)
            小鼠 抗-生物素 linker (即用型)

             ISH (in situ hybridization)

            6 mL

            ENZ-32892-6000

            Rabbit anti-biotin linker

            (Ready-to-use)
            兔抗-生物素linker (即用型)

             ISH (in situ hybridization)

            6 mL

            ENZ-31877

            HPV 16 control slide
            HPV16對照片子

            positive control for DNA in situ hybridization of HPV-16

            1 slide

             

             

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