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ScreenFect ™ 通信 向HeLa細(xì)胞導(dǎo)入siRNA數(shù)據(jù)
下面為大家介紹使用ScreenFect ™ siRNA向HeLa細(xì)胞導(dǎo)入siRNA數(shù)據(jù)的實驗成果及逆轉(zhuǎn)染（1-STEP）Protocol。
◆向HeLa細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)染例子（24孔培養(yǎng)板）
細(xì)胞的前期培養(yǎng)
1. 用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器（T-75燒瓶），將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至半融合狀態(tài)。
配制轉(zhuǎn)染試劑
1. 準(zhǔn)備兩支1.5 mL滅菌試管。
2. 在其中一支試管里加入24.5 μL ScreenFect ™ Dilution buffer。
3. 再往步驟2的試管里加入0.5 μL的ScreenFect ™ siRNA reagent，
使全部容量達(dá)到25 μL。…溶液（A）
（ScreenFect ™ siRNA reagent在使用前進(jìn)行渦旋處理。）
4. 在另一支試管里加入24 μL ScreenFect ™ Dilution buffer。
5. 再向步驟4的試管里加入1 μL的5μmol/L PIK3CB siRNA溶液（5 pmol）…溶液（B）
6. 將溶液（B）全部添加至溶液（A）的試管中。
7. 輕敲試管，使溶液混合均勻。再用臺式離心機(jī)降速處理。
8. 在室溫下孵浴5~20分鐘。
配制配制細(xì)胞懸浮液
1. 從恒溫箱里取出【細(xì)胞的前期培養(yǎng)】的燒瓶。
2. 去除培養(yǎng)基，用PBS清洗一次。
3. 向燒瓶里添加2 mL胰蛋白酶溶液后，放入室溫、5%CO2的恒溫箱里培養(yǎng)，
直到細(xì)胞從培養(yǎng)容器中脫落。
4. 加入約5 mL FBS添加培養(yǎng)基使反應(yīng)停止。
5. 利用移液器使細(xì)胞分散，將全部培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管中。
6. 150×g離心，5分鐘。
7. 去除上清時不要去掉顆粒物。
8. 添加5~10 mL新的培養(yǎng)基，利用移液器使細(xì)胞分散。
9. 用血細(xì)胞計數(shù)板等的細(xì)胞計算器檢測細(xì)胞數(shù)。
10. 檢測出細(xì)胞懸浮液的濃度后經(jīng)過計算，以此配制2.0×105 cells/mL的細(xì)胞懸浮液。
（配制的細(xì)胞懸浮液量可根據(jù)實驗規(guī)模進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)。）
轉(zhuǎn)染
1. 將500 μL在【配制細(xì)胞懸浮液】時配制好的細(xì)胞懸浮液添加至細(xì)胞培養(yǎng)板里。
2. 將50 μL在【配制轉(zhuǎn)染試劑】步驟8中孵浴的DNA-lipid complex添加至細(xì)胞培養(yǎng)板里，
輕搖培養(yǎng)板使溶液混合（也可以先往細(xì)胞培養(yǎng)板里加入50 μL DNA-lipid complex，
再加入500 μL細(xì)胞懸浮液）。
3. 放入CO2的恒溫箱里培養(yǎng)24~48小時后即可進(jìn)行后續(xù)實驗。
◆實驗數(shù)據(jù)
用逆向轉(zhuǎn)染法和正向轉(zhuǎn)染法向HeLa細(xì)胞進(jìn)行PIK3CB siRNA的導(dǎo)入實驗，通過實時定量PCR檢測出PIK3CB mRNA的表達(dá)量。將定量結(jié)果得出的敲減效率，與原來用其他公司的產(chǎn)品進(jìn)行實驗得出的敲減效率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，ScreenFect ™ siRNA擁有高于其他公司產(chǎn)品抑制目的基因表達(dá)的效率。
【逆向轉(zhuǎn)染（1-STEP）】
【正向轉(zhuǎn)染（2-STEP）】
◆產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 包裝 |
299-75001 | ScreenFect ™ siRNA轉(zhuǎn)染試劑 | 基因研究用 | 0.2 mL |
295-75003 | 1 mL | ||
293-75004 | 1 mL×5 |
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