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羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒操作原理

本試劑盒僅供研究使用。

實(shí)驗(yàn)原理

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中羊副結(jié)核病抗體（M.ptAb）表達(dá)。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中副結(jié)核病抗體（M.ptAb）相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中羊副結(jié)核病抗體（M.ptAb）的存在與否。

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒組成

1、30倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶

2、酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8陽(yáng)性對(duì)照0.5ml×1瓶

3、酶標(biāo)包被板12孔×8條9陰性對(duì)照0.5ml×1瓶

4、樣品稀釋液6ml×1瓶10說(shuō)明書(shū)1份

5、顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張

6、顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個(gè)

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒操作步驟

1.編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）

2.加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。

試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00;陰性對(duì)照平均值≤0.10

臨界值（CUTOFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

陰性判定：樣品OD值<臨界值（CUTOFF）者為羊副結(jié)核病抗體（M.ptAb）陰性

陽(yáng)性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為羊副結(jié)核病抗體（M.ptAb）陽(yáng)性。

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒注意事項(xiàng)

1．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物請(qǐng)避光保存。

6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。

羊副結(jié)核病抗體(M.ptAb)ELISA試劑盒保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個(gè)月