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2017-9-12 閱讀(4868)
一、Western Blot實驗為什么要用內(nèi)參?
Western Blot實驗結(jié)果進行內(nèi)參校正已成為一種慣例。目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的組織細胞蛋白上樣，才有比較的基礎，特別是表達量不高時，上樣量的的差別就很有可能影響結(jié)果的分析。因此，在Western Blot試驗中，進行內(nèi)參的檢測，有以下兩點作用：
1、校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的誤差，實驗結(jié)果的準確性；
2、使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否、整個Western Blot顯色發(fā)光體系是否正常。
二、你的內(nèi)參選對了嗎？
作為內(nèi)參的蛋白要符合的標準，可從以下幾方面入手：
1、先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。
樣本來源 | 選擇內(nèi)參 |
哺乳動物組織或細胞 | β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atpase等 |
植物來源 | plant actin、Rubisco |
其他來源樣本研究較少 | 應參照文獻報導，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。 |
2、內(nèi)參的檢測帶與那些目標蛋白的檢測帶在分子量上有所不同；
選擇內(nèi)參抗體時，應該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應該目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD，此時不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。
針對不同樣品制備常用的內(nèi)參以及它們的分子量
3、要考慮目的蛋白表達部位
就一般的蛋白檢測來說，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了，而針對于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時，選擇恰當?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價值。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等，在一些文獻報道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。
4、實際的實驗環(huán)境
有些細胞在某些條件下內(nèi)參表達會出現(xiàn)異常，使其不適合做內(nèi)參。
①某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高，不適合做內(nèi)參。
②在凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內(nèi)參。
③在加入抗癌和抗真菌藥物時，Tubulin的表達易受影響，不適合作為內(nèi)參。
④Lamin B不適合作為胚胎干細胞的內(nèi)參，而PCNA不適合作為非增殖細胞的內(nèi)參等。其他具體可查詢相應文獻。
5、不同的組織特異性
actin 即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內(nèi)參。
三、實驗中使用內(nèi)參的方法你知多少？
在Western Blotting實驗過程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種。
1、超級簡便的標記內(nèi)參使用法，只要在二抗孵育時加入HRP標記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可；
2、普通內(nèi)參，當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。
3、當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開，然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。
