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2017-10-13 閱讀(3520)
科研中的miRNA研究方法總結
microRNA(miRNA) 是一類長度在22nt左右的內源非編碼小RNA，廣泛存在于動物、植物、病毒等多種有機體中。1993年，Lee等人在秀麗新小桿線蟲(C.elegans)中發(fā)現(xiàn)了控制著線蟲時序性發(fā)育的lin-4。2000年，Reinhart等發(fā)現(xiàn)了另一個具有轉錄后調節(jié)功能的小分子RNA：let-7。隨后的幾年時間里，許多研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了這類RNA，并將這些具有時空表達特異性的非編碼小分子RNA命名為microRNA(miRNA)。
從長的初級miRNA(pri-miRNA)到形成成熟的單鏈miRNA到與靶標RNA結合，至少需要四步：先是由核糖核酸酶ⅢDrosha和DGCR8組成的復合物將初始miRNA 轉錄本（pri-miRNA）加工成miRNA前體（pre-miRNA）；接著由轉運蛋白Exportin-5和Ran GTP酶將miRNA從細胞核轉運到細胞質中；第三步是由另一種核糖核酸酶ⅢDrosha將miRNA前體剪切成成熟的miRNA雙鏈，miRNA雙鏈打開，其中一條進入到RNA誘導的沉默RISC復合體（RISC）中，該復合體還包含TarRNA結合蛋白（TRBP）；終RISC復合體根據(jù)miRNA與靶標RNA的互補配對，對靶基因進行剪切，或者翻譯抑制。
miRNA通過作用于相應靶mRNA，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉移等多種生物學過程。預測超過1/3的人類基因都是保守的miRNA靶基因。近些年，隨著科學研究的進展，大量的miRNA已經(jīng)被鑒定出來，截至目前發(fā)現(xiàn)的人的成熟的miRNA有2578條，小鼠的有1908條。雖然miRNA的數(shù)量很多，但大多miRNA的功能并不為人所知。因此，準確快速地預測并鑒定miRNA的靶基因，對研究miRNA
的功能具有十分重要的意義。下面本篇文章將著重介紹一下在醫(yī)學科研領域中如何快速的鑒定與人類疾病相關的miRNA及其功能研究方法。
一、miRNA的定量檢測 成熟miRNA的片段小，只有21bp左右，變異較大，在不同細胞中的表達差異較大，低表達的miRNA為其定量檢測帶來了很大的困難和挑戰(zhàn)。盡管如此，隨著科學的進步，越來越多的miRNA檢測方法被建立起來，促進了miRNA研究進展。下面介紹下在疾病研究中常用的五大miRNA定量檢測方
Northern blotting: 是較為經(jīng)典的檢測各組織和器官中RNA的量和大小及估計其豐度的實驗方法。主要實驗步驟包括：①完整的RNA的分離；②根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離；③將RNA轉移到固相支持物上，在轉移過程中，要保持RNA在凝膠中的相對分布；④將RNA固定到固體支持物上；⑤固相RNA與探針分子雜交；⑥除去非特異結合到固相支持物上的探針分子；⑦對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析。優(yōu)點：高度靈敏，而且通過結合RNA marker可以檢測出miRNA的片段大小，能夠排除實驗被其他小分子RNA污染的可能性性，但Northern blotting對樣品的需求量較高，操作步驟繁瑣，不適用高通量分析。 微陣列芯片技術（microarry）：也稱生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技術，是一種平面的基質載體，上面規(guī)則地、特異性地吸附著基因或基因的產(chǎn)物。當與熒光標記過的樣本雜交后，相應位置熒光信號的強弱即可反映對應基因表達的豐度。其優(yōu)點是能夠同時檢測多個樣本的表達量，實現(xiàn)miRNA的高通量分析。但芯片檢測技術對miRNA的純度質量要求較高，現(xiàn)行的RNA提取為了獲取高質量了RNA，往往會在純化過程丟失掉許多小分子RNA，影響一些低表達RNA的檢測。另外芯片技術的一個突出的缺點就是信息質量的穩(wěn)定性和可重復性較差。這些方面都需要改進。
原位雜交：該技術可以更為直觀的顯示出miRNA的表達情況，可直接觀測到miRNA的表達時間，表達分布范圍，具體位置等，不僅可以檢測不同細胞系單個細胞中的miRNA表達，還可在不經(jīng)分類和分離的情況下，比較不同細胞系中miRNA的表達水平。但miRNA分子太小，要對傳統(tǒng)的原位雜交技術進一步改進，增加雜交的親和性，結合牢固性，以防止洗脫過程中的丟失，造成結果不準確。 RT-PCR：與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏的檢測出低表達的miRNA，并適合于高通量篩選。由于miRNA分子片段小，研究者們通過對其反轉錄引物進行特異性設計使得RT-PCR定量檢測miRNA成為可能，根據(jù)所用引物的不同可以將其分為兩大類，一類是Oligo d(T)特異的RT引物，miRNA在反轉錄前需要對其3’末端加多聚尾Poly(A)，再使用Oligo-Universal Tag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應，終生成miRNA對應的cDNA*鏈。莖環(huán)結構的RT引物由可以自身呈莖環(huán)狀的特異序列加上6個到8個miRNA3’端反相互補堿基組成，一條miRNA序列對應一個特異的莖環(huán)結構的反轉錄引物。兩者相比，前者引物設計容易且檢測通量高，但檢測靈敏度和特異性比后者低。熒光定量PCR根據(jù)所用熒光來源不同可以分為SYBR Green染料法和TagMan探針法。 miRNA 深度測序：該技術能夠直接對樣本中特定大小的miRNA分子進行高通量測序，可以在無需miRNA 序列信息的前提下研究miRNA的表達譜，并發(fā)現(xiàn)和鑒定新miRNA 分子。新一代測序常使用的3種平臺是Illumina的基因組分析儀、Roche454基因組測序儀以及 AB Life Technologies的SOLiD系統(tǒng)。因為miRNA的序列較短，較多應用于miRNA檢測的新一代測序技術平臺為Illumina基因組分析儀和AB Life Technologies的SOLiD系統(tǒng)。Illumina基因組分析儀具有所需樣品少，數(shù)據(jù)誤差小，操作流程簡單等特點。SOLiD系統(tǒng)的讀長為35nt，且準確度高，單次運行所得的數(shù)據(jù)量大，特別適用于miRNA的研究。而Roche454基因組測序儀測序讀長可達400~500堿基，而miRNA序列長度僅為22堿基，所以該測序儀常用于新物種的基因組測序和轉錄組測序，極少應用于miRNA測序。
